[发明专利]猪外周血单核淋巴细胞PD-L1重组质粒的构建、基因丰度实时检测方法及其应用

说明书

技术领域

本发明属于分子病理学与免疫学技术领域，具体涉及猪外周血单核淋巴细胞PD-L1重组质粒的构建、基因丰度实时检测方法及其应用。

背景技术

猪瘟（Classical swine fever，CSF）是由猪瘟病毒（Classical swine fever virus，CSFV）引起的一种急性、热性、高度接触性传染病。研究表明，CSFV主要感染单核-巨噬细胞系统，引起严重的淋巴细胞减少、血小板凝集和凝血机能障碍，以及胸腺、骨髓等中枢免疫器官的萎缩。CSFV还能通过引起机体抗病毒反应降低、抑制感染细胞的凋亡、促进未感染细胞的凋亡等途径造成机体免疫功能损伤。

程序性死亡配体（PD-L1）及其程序性死亡受体-1(PD-1)是CD28/B7超家族成员，广泛表达于各种组织。PD-1/PD-L共刺激信号视机体的炎症程度、免疫状态和遗传背景不同而激活或抑制，主要参与T细胞的中枢及外周免疫耐受。与其他CD28超家族成员相比，PD-1/PD-L信号通路发挥着更广泛和复杂的免疫调节作用，与自身免疫病、肿瘤、慢性感染及炎症密切相关。在免疫调节方面，PD-L1与其受体PD-1共同介导PD-1:PD-L信号通路的激活，在中枢免疫和外周免疫反应中传递免疫耐受和免疫抑制信号，对抗原特异性T、B细胞的功能、T细胞的增殖、细胞因子的分泌和杀伤能力都有抑制作用，阻断该通路后可以恢复T细胞的大部分功能。经相关研究证实，一些病毒的感染可以诱导PD-L1及其受体PD-1的表达，从而影响PD-1:PD-Ls通路，使病毒逃避免疫系统的监视与杀伤，引起机体产生免疫抑制和持续性感染。因此，PD-L1及其受体PD-1近年来逐渐成为人们在慢性持续性病毒感染、免疫耐受性疾病、肿瘤等免疫抑制性疾病研究中所关注的热点，而在动物免疫抑制性疾病或病毒持续性感染方面，T细胞免疫抑制通路PD-1:PD-Ls的研究才刚刚起步，特别是在猪病毒性疾病方面的研究还少见报道。

近年来，实时荧光定量PCR（Real-Time PCR） 技术为基因丰度检测提供了全新的方法，和传统的方法相比，具有敏感性高、特异性强、操作简便、成本低以及定量准确被广泛应用，它可以通过检测目标序列PCR扩增的荧光信号强度达到实时监控的目的。然而对猪外周血单核细胞中PD-L1基因的丰度的Real-Time PCR检测体系建立及应用的研究尚未见报道。

发明内容

本发明要解决的技术问题在于：本发明提供了一种猪外周血单核淋巴细胞PD-L1实时荧光定量PCR阳性标准重组质粒的构建方法；

在此基础上本发明建立了一种PD-L1基因丰度的实时荧光定量PCR检测方法，该方法具有敏感性高、特异性强等优点；

本发明通过研究外周血单核细胞中PD-L1的变化规律，为猪PD-L1分子检测的定量分析提供了技术平台，并能用于分析猪感染病毒性疾病如CSF后PD-L1基因的转录水平的变化规律中。

本发明的技术方案：

猪外周血单核淋巴细胞PD-L1实时荧光定量PCR阳性标准重组质粒的构建方法，包括以下步骤：

采集仔猪的外周血，分离出外周血单核淋巴细胞，提取外周血单核淋巴细胞的总RNA，将总RNA反转录成cDNA，将cDNA保存于-20℃，采用普通PCR方法扩增PD-L1目的基因片段；

采用普通PCR方法扩增PD-L1目的基因片段，将该目的基因片段经琼脂糖凝胶电泳检测，并回收纯化；然后将PD-L1目的基因纯化片段与pMD 18-T载体连接，转化至感受态细胞DH5α中，提取重组质粒，经克隆筛选后进行测序分析，得到与目的基因片段相同序列的阳性标准重组质粒；

其中普通PCR扩增时的反应体系为25μL，反应体系如下：2μL样品cDNA模板，2.5μL 10×PCR Buffer，2μL dNTP，浓度均为20μmol/L的正向引物和反向引物各0.5μL，0.5μL的TaqDNA 聚合酶，其余为无菌三蒸水；普通PCR反应程序：95℃热启动1min；94℃变性30s；55℃退火30s；72℃延伸30s，30个循环，最后72℃延伸10min；

其中，正向引物F为：5′- AATGGCGAGGAAGACCTGAA -3′，

反向引物R为：5′- CAGCAGTAAACCCCTGCATCT -3′。

所述目的基因片段为SEQ ID No.1；所述普通PCR扩增时的反应程序：95℃热启动1min；94℃变性30s；55℃退火30s；72℃延伸30s，30个循环，最后72℃延伸10min。