[发明专利]重组多刺激分子细胞及其制备方法和在NKT细胞扩增中的应用

权利要求书

1.重组多刺激分子细胞，其特征是：其为能在人急性髓系白血病细胞MEG-01细胞表面稳定表达CD64、CD137L和mIL-18的细胞 ，即ME64/CD137L/mIL-18细胞。

2.制备权利要求1所述的重组多刺激分子细胞的方法，其特征是，包括以下步骤：

a、构建CD64真核表达载体，将该载体转染MEG-01细胞，再经筛选，分选，获得能够在MEG-01细胞表面稳定表达CD64的细胞，即ME64细胞；

b、制备双表达CD137L和mIL-18共刺激信号的真核表达载体；

c、将步骤b制得的真核表达载体转染所述ME64细胞，再经筛选，分选，获得能够在ME64细胞表面稳定表达CD137L和mIL-18的细胞，即ME64/CD137L/mIL-18细胞。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征是，步骤a具体为：获取CD64的cDNA，再将CD64 cDNA进行PCR扩增，获得CD64 cDNA的PCR扩增产物；将所述CD64 cDNA的PCR扩增产物与pGEMT载体连接，构建pGEMT-CD64原核表达载体；再分别对pGEMT-CD64和pcDNA3.1(+)进行NotⅠ和ApaⅠ双酶切，并对酶切产物进行连接，构建pcDNA3.1(+)-CD64真核表达载体，即CD64真核表达载体；再将CD64真核表达载体转染MEG-01细胞，经G418筛选，FACS分选，获得ME64细胞；

其中，扩增CD64 cDNA的引物的序列为：

上游序列：5'- TATGCGGCCGCATGGATTTCACTGCTCCCACC-3'

下游序列：5'- GGGGGGCCCAATAGATAGACCGTCACCCTT-3'。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征是：所述PCR扩增反应条件为：94℃预变性5分钟，94℃30秒，55℃1分钟，72℃90秒，最终72℃延伸30分钟。

5.根据权利要求2所述的方法，其特征是，步骤b具体为：

Ⅰ、获取CD137L的cDNA，再将CD137L cDNA进行PCR扩增，获得CD137L cDNA的PCR扩增产物；将所述CD137L cDNA的PCR扩增产物与pGEMT载体连接，构建pGEMT-CD137L原核表达载体；其中，扩增CD137L cDNA的引物的序列为：

上游序列：5'- GGCCGCCATGGAATACGCCTCTGA-3'

下游序列：5'- CAGCTGTGGGTGAGGAAGGGGTTC-3'；

Ⅱ、获取mIL-18的cDNA，再将mIL-18 cDNA进行PCR扩增，获得mIL-18 cDNA的PCR扩增产物；将所述mIL-18 cDNA与pGEMT载体连接，构建pGEMT- mIL-18原核表达载体；其中，扩增mIL-18 cDNA的引物的序列为：

上游序列：5'- GAATTCGCCTGGACAGTCAGCAAG-3'

下游序列：5'- GAGCTCTCTAACGTGGTAACGCGA-3'；

Ⅲ、用NotⅠ和SalⅠ酶分别对pGEMT-CD137L和pVitro-2进行酶切，并对酶切产物进行连接，构建pVCD137L真核表达载体；

Ⅳ、用EcoRI和XhoI酶分别对pGEMT- mIL-18和pVCD137L进行酶切， 并对酶切产物进行连接，制得双表达CD137L和mIL-18的真核表达载体pVCD137L- mIL -18。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征是：步骤Ⅲ中，所述pGEMT-CD137L的酶切产物与pVitro-2的酶切产物按照3:1的比例进行连接；

步骤Ⅳ中，所述pGEMT- mIL-18的酶切产物与pVCD137L的酶切产物按照3:1的比例进行连接。

7.权利要求1或2所述的重组多刺激分子细胞在NKT细胞体外扩增中的应用。