[发明专利]一种美洲大蠊过敏原制剂的制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及过敏原制剂的制备技术领域，具体为一种美洲大蠊过敏原制剂的制备方法。

背景技术

过敏性疾病是人类重大疾病之一。其发病率目前估计约占世界人口的22％，而且正以每年大于1％的速度增加，且以儿童患者的发病率上升最为明显。其危害性不能简单地以其死亡率来衡量，而要考虑疾病的高发作频度给患者造成的经济负担。由于过敏性疾病多发生在年轻人群，其对人类社会和经济的影响就更严重。我国在工业化转型过程中，其发病率显著增加，严重影响了我国受累人口的生活质量、工作效率，加重了患者的经济负担。仅欧洲每年用于治疗过敏患者的费用已经超过500亿欧元，并继续以3倍于其它疾病的增速在发展。美国每年仅哮喘和过敏性鼻炎的花费已分别高达64和60亿美元。全国尚有数以亿计的人有潜在的诊断和治疗需求。因此，积极扶持我国过敏原体内诊断和治疗制剂研发，能有效防止因国外产品对我国的渗入造成的医疗费用上涨，减少国家医疗财政支出和人民负担。

过敏原标准化是一项世界性难题，我国在此领域与欧美国家差距逐渐拉大。例如，美国为有效管理过敏原制剂，专门成立了FDA／CBER／LIB实验室，旨在建立过敏原参考品、过敏患者参考血清池、标准的生物效价检定方法、设定有效合理的质量放行标准。1981年，美国市场上有超过5000种非标准化过敏原产品出售，其中绝大部分均没有安全性和有效性验证。而现今，FDA经过多年过敏原标准化体系规范，正式批准的标准化过敏原仅19种。德国生物制品研究所-PEI研究所(Paul Ehrlich Institute，PEI)执行了同样的策略，强制在德国推行标准化过敏原，加强监管，关闭了数十家过敏原生产企业。欧盟通过连续三届框架科技计划资助，建立了桦树主要致敏蛋白重组参考品rBet v1以及标准的ELISA检定方法，准备写入欧洲药典。我们在本项目中利用新的提取和重组技术，制备出第二代标准化过敏原制剂。

早在上世纪60年代，就有蟑螂引起哮喘的报道。但直到近年来，蟑螂在哮喘发病中的作用才逐渐受到人们的关注。资料显示，美国哮喘患者中蟑螂过敏的发生率达到27.5～42％，欧洲为3.9～24.5％，非洲为30～44.6％，在我国，北京、上海等大城市中儿童哮喘患者的蟑螂过敏率也高达27.8～43.8％。哮喘发病率的不断升高，在很大程度上与蟑螂污染加剧有关，蟑螂已经成为仅次于尘螨的第二大室内过敏源。目前常见的美洲大蠊过敏原已经被鉴定出来，使第二代标准化美洲大蠊过敏原制剂的制备有了依据。但是，到目前为止，尚无公开发表的美洲大蠊制备工艺，而美洲大蠊过敏原制剂又有较大的临床需求，以此需要研发出新一代标准化美洲大蠊过敏原制剂。

发明内容

本发明所解决的技术问题在于提供一种美洲大蠊过敏原制剂的制备方法，以解决上述背景技术中的问题。

本发明所解决的技术问题采用以下技术方案来实现：一种美洲大蠊过敏原制剂的制备方法，包括如下步骤：

(1)美洲大蠊在-80℃冰箱中灭活；在手术显微镜下去除肠道；用75％乙醇清洗、浸泡15分钟，风干后置于-80℃冰箱保存备用；

(2)取适量的冰冻美洲大蠊在液氮中研磨成粉末；

(3)丙酮脱脂2次后，置于-80℃冰箱中冷冻，随后在真空冷冻干燥机内冻干成粉末；

(4)称取美洲大蠊粉末1g，加入20L的提取液，在涡旋振荡器上充分混匀，置4℃摇床上抽提0.5小时至4小时，之后在转速为12000g，4℃条件下离心30min，吸取上清，即为美洲大蠊过敏原提取物；

(5)用特异性Per a1、Per a2、Per a3、Per a4、Per a6、Per a7、Per a9、Per a10及1-2种次要过敏原抗体鉴定美洲大蠊过敏原粗提物中主要过敏原Per a1、Per a2、Per a3、Per a4、Per a6、Per a7、Per a9、Per a10及1-2种次要过敏原的含量及比例；

(6)根据步骤(5)鉴定结果加入酵母菌或昆虫表达的重组蛋白质，使其达到美洲大蠊自身的五种主要过敏原含量。

所述1-2种次要过敏原包括Per a5。

所述美洲大蠊自身的五种主要过敏原含量比例为65％～75％。

所述提取液为高渗磷酸盐缓冲液，其配方为：NaCl35.1g～70.2g KCl0.2gNa₂HPO₄1.42g KH₂PO₄0.27g，加入800ml ddH₂O，调节pH为5.0～9.0，定容至1L。