[发明专利]一种检测α2珠蛋白基因点突变的巢式非对称PCR试剂盒

说明书

技术领域

本发明属于分子检测领域，具体涉及一种巢式非对称PCR解链荧光分析检测α2珠蛋白基因点突变试剂盒。

背景技术

人类α-珠蛋白基因簇位于16号染色体上，表达α珠蛋白链，与β珠蛋白链结合，形成具有功能血红蛋白四聚体。正常情况下，人类珠蛋白基因所表达的α类和β类珠蛋白链比例适当（1:1），当α珠蛋白基因缺陷，导致α链合成减少而β链相对过剩，即可导致α-地中海贫血疾病。地中海贫血（简称“地贫”）是全球最常见、对人类健康影响最大的单基因遗传病之一，主要集中在地中海沿岸国家、东南亚、少数非洲地区和我国南方，保守估计全世界携带者近2亿人。临床上常见α-地贫和β-地贫。但α-地贫的人群携带率远高于β-地贫。此病无有效治疗手段，应用相应分析技术通过人群筛查及产前诊断阻止重症患儿出生是国内外公认的首选预防措施。导致α链合成减少的根本原因是α珠蛋白基因突变，包含大片段缺失和点突变两种类型，其中由α珠蛋白基因点突变而导致的α-地贫又称为α-地贫基因点突变或非缺失型α-地贫。

正常人每条16号染色体上有两个高度同源的α珠蛋白基因，即α2和α1，正常情况下，α2较α1功能更强，α2约占基因表达量的2/3，α1约占基因表达量的1/3。目前的研究及分子流行病学调查结果显示，α-地贫基因点突变主要发生在功能较强的α2珠蛋白基因上，如中国人群中常见的WS、QS、CS，以及次常见的CD30、CD31等突变类型。

当前α-地贫基因点突变的分子诊断和产前诊断策略，是采用相应的技术方法，分析α珠蛋白基因是否存在点突变。检测技术的发展历程中，扩增阻碍突变系统PCR（ARMS-PCR），是分别针对每一个突变位点，采用两个PCR反应管逐一检测，操作繁琐、费时费力，并且这种技术的检测条件难以控制，易于出现假阴性和假阳性结果。随后采用的等位基因特异性寡核苷酸杂交法（ASO），大大减少了假阴性和假阳性结果，但仍需逐一检测每一个突变位点，检测通量低，费时费力。当前在临床上常规使用的反向点杂交法（RDB），可同时检测WS、QS和CS三种突变类型，在一定程度上减小了劳动强度，增加了检测通量，可是，此技术的操作流程依然繁琐，先PCR扩增α2珠蛋白基因，然后再通过变性、杂交、洗膜、显色等一系列操作再观察检测结果，同时，PCR产物的开盖操作也大大增加了实验室携带污染的风险。DNA测序分析也是当前可选的一种α珠蛋白基因点突变检测方案，此技术操作过程是先PCR扩增，再PCR产物纯化、测序PCR反应、测序仪上毛细管电泳分析等，同样存在操作繁琐、携带污染等问题。总的来说，目前使用α2珠蛋白基因点突变检测方法，检测成本高、工作量大、操作繁琐、检测通量小，难以实现自动化和标准化，且存在PCR产物携带污染等技术局限，不能满足当前α-地贫的大规模人群筛查和临床常规分子诊断需要。

随着目前以降低地贫患儿出生率为目标的预防计划与措施的相继实施，以及地贫分子机制及分子流行病学的深入研究，准确可靠、简单实用、能实现自动化和标准化、适合大规模人群筛查和常规分子诊断的高通量检测技术与方法，是这些项目实施的技术支撑条件，更是当前地中海贫血分子诊断的迫切需要。针对上述α2珠蛋白基因点突变检测分析的技术局限，研发相应的技术方法，一次性闭管操作以防止PCR产物携带污染，单反应管检测多种突变类型以提高检测通量且简化操作强度，仪器自动检测分析以实现自动和标准化，是目前方法学研究的主要方向。

发明内容

为了解决现有技术中所存在的不足，本发明的目的在于提供一种可以一次性闭管检测α2珠蛋白基因中WS、QS、CS、CD30、CD31五个点突变类型的检测试剂盒。

本发明所采取的技术方案是：

用于检测α2珠蛋白基因点突变的巢式非对称荧光PCR试剂盒，所述试剂盒包括：

（1）用于特异性扩增α2珠蛋白全序列的引物对；

（2）用于扩增CD30/CD31目的片段DNA单链的引物；

（3）用于扩增WS/QS/CS目的片段DNA单链的引物；

（4）特异性检测α2珠蛋白基因WS、QS、CS、CD30、CD31五个点突变序列的野生型及突变型的荧光探针，以及相对应的淬灭探针，通过在荧光探针上修饰不同的荧光信号和/或不同的解链温度来区分WS、QS、CS、CD30、CD31五个点突变序列的野生型及突变型。

所述用于特异性扩增α2珠蛋白全序列的引物对的Tm值比其他引物或荧光探针、淬灭探针的Tm值高5-10℃。

作为优选的，所述用于特异性扩增α2珠蛋白全序列的引物对的Tm值≥72℃。