[发明专利]用于电子烟烟液细胞毒性评价的中性红吸收测定方法

说明书

技术领域

本发明涉及电子烟烟液体外细胞毒性的测定，具体说是基于中性红染料分析电子烟烟液染毒后细胞存活率的定量测定方法。

背景技术

随着人们对“吸烟有害健康”的了解，各国政府均在现行法律规定范围内积极采取和实行有效的立法、行政或其他措施，禁止在公共场所吸烟。2005年，中国签署了世界卫生组织《烟草控制框架公约》。2012年，中国政府发布《中国烟草控制规划（2012-2015年）》，提出创造无烟环境，实施公共场所全面禁烟。室内禁烟措施导致电子烟等新型产品在各国市场上得到迅速增长，消费群体不断扩大。电子烟又名电子尼古丁传送系统。世界卫生组织对电子尼古丁传送系统的官方定义为：电子尼古丁传送系统是一种消费产品，能够向肺传输尼古丁。电子烟一般都由三部分构成：烟杆、雾化器、烟液。近年来，电子烟以“保健”，“戒烟”，“清肺”等为宣传口号，以网络为主要营销途径，在中国地区销量大增。某些电子烟产品还宣称其比传统卷烟的危害性更小。然而目前对电子烟的毒性评价研究较少，相关研究仅使用3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐法（MTT法）对电子烟烟液或烟雾的细胞毒性进行评价，结果表明不同电子烟烟液的细胞毒性相差很大。

检测化合物细胞毒性可通过多种生物学终点进行，例如通过测定酸性磷酸酶或其他蛋白活性来计算细胞数量、测定细胞代谢活性（例如MTT法）以及检测细胞膜的完整性等生物学终点进行评价。根据不同检测原理开展细胞毒性评价，可从不同角度揭示化合物细胞毒性的作用机理。

中性红吸收试验是广泛接受的用来评价药物、化妆品、工业化工原料及环境污染物对不同细胞的毒性的体外细胞毒性测试方法。在众多细胞毒性测试方法中，中性红试验是最为灵敏的评价卷烟烟气冷凝物细胞毒性的方法。然而，该方法是否可用于评价电子烟烟液细胞毒性还未见文献报道。

发明内容

本发明基于中性红细胞毒性试验的原理，根据电子烟烟液细胞毒性的特点，通过筛选适用于电子烟烟液细胞毒性评价的细胞系，优化染毒浓度，建立的一种电子烟烟液体外细胞毒性的测定方法，该方法具有检测通量高，灵敏度高，定量准确等优势。

本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：

一种用于电子烟烟液细胞毒性评价的中性红吸收测定方法，包括以下步骤： 

1） 溶液的制备：

（1）中性红染液：0.2 g中性红加双蒸水至100 ml，过滤除菌并用细胞培养基稀释至50 μg/ml；

（2）中性红萃取液：冰醋酸∶无水乙醇∶水＝1∶50∶49；

（3）阳性对照：十二烷基硫酸钠（SDS）（200 μg/ml，100% 细胞致死率浓度）；

（4）电子烟烟液染毒溶液：由于电子烟烟液的主要组成成分包括丙二醇、丙三醇等保润剂，导致电子烟烟液溶液密度较大，无法准确移取体积进行染毒溶液的配制。因此，本发明中使用精度不小于万分之一的分析天平对电子烟烟弹液进行准确称量，然后使用细胞培养基溶液稀释配制。

2） 细胞样本的处理：

（1）细胞接种：本方法适用的细胞种类为人肺正常上皮细胞BEAS-2B细胞。向96孔板的每孔中加入100 μL的BEAS-2B细胞悬液。

（2）电子烟烟液染毒：细胞培养24 h后，吸去培养液，96孔板（除最外周36孔）每列6孔为一组分别设置为阴性对照组、8个不同剂量的电子烟烟液染毒组和阳性对照组。阴性对照组每孔加入 100μl细胞培养基、电子烟烟液染毒组每孔加入100μl电子烟染毒溶液、阳性对照组每孔加入200μg/ml的SDS溶液，96孔板的最外周36个孔中每孔加入100μl稀释培养液作为溶剂背景对照，于37 ℃、5% CO₂ 条件下培养24 h。

（3）中性红染色：电子烟烟液染毒24 h后，吸去培养液，每孔加入100 μl中性红染液，于37 ℃、5% CO₂ 条件下培养3 h。3 h后取出96孔板，吸去中性红染液，每孔加入200 μlPBS洗2次，加入100ul中性红提取液。室温下快速振荡15~20 min，使用酶标仪检测540 nm波长处的吸光值。

（4）结果与分析：计算相对吸光值，相对吸光值代表细胞存活率。相对吸光值C= A₅₄₀/ A_{540阴性对照}

注：所用SDS阳性对照为100%细胞致死浓度，故A_{540阳性对照}应小于等于0.3。