[发明专利]用于乳腺癌早中期快速诊断试剂盒及其检测方法

权利要求书

1.用于乳腺癌早中期快速诊断试剂盒，包括捕获抗体，其特征在于，所述捕获抗体包括半乳糖凝集素和糖链抗原15-3分别制得的单克隆抗体。

2.根据权利要求1所述的用于乳腺癌早中期快速诊断试剂盒，其特征在于，所述捕获抗体还包括人类天冬胺酰基β－羟化酶制得的单克隆抗体。

3.根据权利要求2所述的用于乳腺癌早中期快速诊断试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括检测抗体，所述检测抗体包括半乳糖凝集素、糖链抗原15-3和人类天冬胺酰基β－羟化酶分别制得的多克隆抗体。

4.根据权利要求3所述的用于乳腺癌早中期快速诊断试剂盒，其特征在于，所述捕获抗体的制备方法包括的步骤如下：

（1）抗原的制备：把半乳糖凝集素、糖链抗原15-3和人类天冬胺酰基β－羟化酶的基因克隆到真核表达载体，并在哺乳动物细胞中实现蛋白的表达，纯化后得到抗原；

（2）捕获抗体的制备：将上述抗原免疫哺乳动物，得到相应的单克隆抗体为捕获抗体。

5.根据权利要求3所述的用于乳腺癌早中期快速诊断试剂盒，其特征在于，所述检测抗体的制备方法包括的步骤如下：

（1）抗原的制备：把半乳糖凝集素、糖链抗原15-3和人类天冬胺酰基β－羟化酶的基因克隆到真核表达载体，并在哺乳动物细胞中实现蛋白的表达，纯化后得到抗原；

（2）检测抗体的制备：将上述抗原免疫哺乳动物，得到相应的多克隆抗体为检测抗体。

6.根据权利要求1-5任一所述的用于乳腺癌早中期快速诊断试剂盒，其特征在于，所述半乳糖凝集素是半乳糖凝集素-3。

7.根据权利要求6所述的用于乳腺癌早中期快速诊断试剂盒，其特征在于，所述捕获抗体预先包被于微量滴定板的孔内。

8.根据权利要求6所述的用于乳腺癌早中期快速诊断试剂盒的制备方法，其特征于，其包括以下步骤：

（1）抗原的制备：将半乳糖凝集素、糖链抗原15-3和人类天冬胺酰基β－羟化酶基因克隆到真核表达载体，并在哺乳动物细胞中实现蛋白的表达，纯化后得到所需的抗原；

（2）捕获抗体的制备：将上述抗原免疫哺乳动物得到相应的单克隆抗体，所述单克隆抗体作为本试剂盒的捕获抗体；

（3）检测抗体的制备：将上述抗原免疫哺乳动物得到相应的多克隆抗体，所述多克隆抗体作为本试剂盒的检测抗体；

（4）捕获抗体包被：

①.用碳酸盐/碳酸氢盐缓冲液将浓度为1μg/ml的捕获抗体包被微量滴定板的孔；

②.封盖微量滴定板并在4℃下孵育过夜；

③.弃去包被液，并用洗涤液洗涤微量滴定板两次，每次在微孔中加入200μl PBST，除去洗涤液和剩余的液滴，晾干放于4℃环境中；

（5）封闭：每孔添加200μl封闭缓冲液，封闭包被孔中剩余的蛋白质结合位点。

9.根据权利要求6所述的用于乳腺癌早中期快速诊断试剂盒的检测方法，其特征于，包括以下步骤：

（1）抗原的制备：将半乳糖凝集素、糖链抗原15-3和人类天冬胺酰基β－羟化酶基因克隆到真核表达载体，并在哺乳动物细胞中实现蛋白的表达；

（2）捕获抗体的制备：将上述抗原免疫哺乳动物得到相应的单克隆抗体，所述单克隆抗体作为本试剂盒的捕获抗体；

（3）检测抗体的制备：将上述抗原免疫哺乳动物得到相应的多克隆抗体，所述多克隆抗体作为本试剂盒的检测抗体；

（4）捕获抗体包被：

①.用碳酸盐/碳酸氢盐缓冲液将浓度为1μg/ml的捕获抗体包被微量滴定板的孔；

②.封盖微量滴定板并在4℃下孵育过夜；

③.弃去包被液，并用洗涤液洗涤微量滴定板两次，每次在微孔中加入200μl PBST，除去洗涤液和剩余的液滴，晾干放于4℃环境中；

（5）封闭

①.在微量滴定板的每个孔添加200μl封闭缓冲液，封闭包被孔中剩余的蛋白质结合位点；

②.封盖微量滴定板并在37℃孵育1小时；

（6）加样

①.将100μl样品添加到每个孔，在37℃孵育60分钟;

②.弃去样品，并洗涤微量滴定板三次，每次在微孔中加入200μl PBST；

③.将100μl浓度为0.5μg/ml的检测抗体添加到每个孔；

④.封盖微量滴定板并在37℃孵育1小时；

⑤.用PBST洗涤微量滴定板四次；

⑥.添加100μl标记二抗；

⑦.封盖微量滴定板并在37℃孵育1小时；

⑧.用PBST洗涤微量滴定板四次；

(7)检测

①.将TMB溶液添加到每个孔，孵育15-30分钟，添加等体积的终止液，然后在450nm处读取光密度。