[发明专利]一种肿瘤特异性杀伤细胞制剂及其制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种抗肿瘤的细胞免疫治疗新技术，特别涉及一种初始T细胞来源的新型肿瘤特异性杀伤细胞（DC-CIK-CTL）制剂及其制备方法。

背景技术

中国专利2012101271586描述了一种效应细胞制备方法，即应用CD4+和CD8+混合的初始T细胞，制备DC-CIK-CTL效应细胞，同时提供一种应用复合制剂对肿瘤微环境进行干扰，从而打破肿瘤免疫耐受，在此基础上进行效应细胞回输治疗的新技术。其中DC-CIK-CTL效应细胞的制备方法是：外周血获得单状核细胞，体外分离出DC细胞和总T细胞。DC细胞经过5天的培养扩增并加入病人自体肿瘤相关全抗原至第7天成熟，获得肿瘤特异性DC疫苗备用。T细胞则进一步分离出初始CD4+T细胞和初始CD8+T细胞，将两种初始T细胞按1：1混合，经INF-γ冲击后，应用CD3单抗和IL-2扩增至第7天制备CIK。半数细胞移瓶后加入DC疫苗激活制备肿瘤特异性CTL，另外半数细胞继续CIK培养，至第10天分别收获CIK和CTL效应细胞，混合移入含有2.0g人血白蛋白的250ml0.9%氯化钠中，制备成高效DC-CIK-CTL。回输前首先对病人实施微环境干扰，方法是：环磷酰胺（CTX）600-1200mg静脉滴入，1次/日共2天，次日静脉回输DC-CIK-CTL，2次/日，共三天。细胞回输治疗第一天引流区域淋巴结注射DC疫苗，每周一次共三次。

但实验发现使用该方法，临床有效率虽然有所提高，但还未达到理想程度，为此本发明人对上述方法进行了改进，取得了意想不到的技术效果。

发明内容

本发明的主要目的在于：解决目前DC-CIK-CTL方法肿瘤杀伤率低、临床有效率低的问题，应用本技术，可以显著提高肿瘤的杀伤效率，提高临床有效率和客观疗效。

为保证上述技术的实施，本发明提供了一种特异性肿瘤杀伤细胞制剂及其制备方法。

本发明的制剂包括肿瘤特异性杀伤细胞（DC-CIK-CTL）和胸腺五肽。

本发明提供一种肿瘤特异性杀伤细胞制剂，其特征在于，含有肿瘤特异性杀伤细胞以及胸腺五肽，其中胸腺五肽加入量为5mg。

本发明的制剂，所述肿瘤特异性杀伤细胞，制备方法采：

外周血单状核细胞采集：

应用COBESPECTRA细胞成分分离机，按照说明书设定参数设定程序，外周血循环6000-8000ml，采集单状核细胞120-140ml，分装入50ml离心管，日立细胞离心机1500转/分离心5分钟，收集上层血浆移入50ml离心管，制备自体灭活血清，4℃冷藏备用，收集细胞，30ml生理盐水稀释，移入含淋巴细胞分离液15ml的50ml离心管，应用水平转头离心机离心2000rpm×15分钟，一次性吸管吸取中间白色细胞层，分别取15ml单状核细胞移入含40ml生理盐水的50ml离心管，轻柔吹打混匀，离心1500rpm×10分钟，弃上清，加入生理盐水45ml轻柔吹打混匀，离心1000rpm×5分钟洗涤，弃上清，重复洗涤3次后，加入1640培养基，细胞计数，

DC和T细胞分离：

175cm²培养瓶分别加入1640无血清培养基20ml，室温下放置20分钟行培养瓶活化，将单状核细胞平均分装到培养瓶中，细胞浓度控制在1×10⁷个/ml，加入终浓度10-20％的自体血清，37℃，5%CO₂饱和湿度培养箱中孵育30-60分钟，移出悬浮细胞为外周血总T细胞，剩余贴壁细胞即为DC细胞，

DC成熟和肿瘤特异性DC疫苗制备：

贴壁的DC细胞中加入无血清DC培养基20ml，置于37℃，5%CO₂饱和湿度培养箱中扩增培养5天，第6天加入自体肿瘤相关抗原50ug/ml，次日补充10-15%的自体血清，培养2天后于第8天回收，获取DC疫苗，流式细胞检测CD83、HLA-DR表达，部分用于CTL制备，部分液氮冻存用于疫苗接种治疗，

初始CD4+T细胞及初始CD8+T细胞分选：

1）、应用美国BD、美国R&D、或德国美天旎公司生产的免疫磁珠试剂盒进行初始CD4+T细胞及初始CD8+T细胞分选，采用美天旎公司的50nm微小磁珠，该磁珠可被细胞生物降解而无需解离磁珠，对细胞无损伤、无激活、且对细胞生理功能无影响，