[发明专利]犬星状病毒的半套式RT-PCR检测方法

说明书

本申请是以下申请的分案申请：申请日：2011年12月23日；申请号：201110440713.6；发明名称：“犬星状病毒的半套式RT-PCR检测方法”。

技术领域

本发明涉及生物技术，具体涉及一种犬星状病毒的半套式RT-PCR检测方法。

背景技术

星状病毒是无囊膜的单股正链RNA病毒，呈五角或六角的星形，属于星状病毒科。星状病毒于1975年首次由Madeley和Cosgrove等用电镜检测胃肠炎患儿粪便中发现。犬星状病毒最早是在1980年时Willians用电镜观察腹泻犬粪便时发现的。星状病毒可引起人类、犬、猫、水豹等多种动物呕吐、腹泻、发热等症状，特别是婴幼儿、幼龄动物、老人以及免疫功能低下者，是典型的人兽共患病。目前，世界各地均已有星状病毒感染的报道，在志愿者和自然感染者的研究中均已证实星状病毒感染与腹泻密切相关。

星状病毒早期检测是以电镜观察和酶联免疫技术为基础，近年来随着分子生物学技术的应用，RT-PCR方法成为检测星状病毒的重要手段，但它们在特异性、敏感性等方面都存在一定的局限性。为此，本研究根据套式RT-PCR原理，建立了一种快速、准确、特异的犬星状病毒检测方法，为人类的健康，动物的健康以及环境的保护提供了有力的基础。

发明内容

本发明的目的，在于克服现有技术的不足之处，提供一种犬粪便的犬星状病毒的半套式RT-PCR检测方法。

本发明的技术方案是：一种犬星状病毒的半套式RT-PCR检测方法是：将检测样品进行预处理后，提取总RNA；将总RNA逆转录到cDNA；通过半套式RT-PCR反应获得扩增产物；取扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳鉴定；若检测样品在预定分子量大小的位置出现特异性扩增条带，则判定为阳性，否则为阴性。

所述的半套式RT-PCR反应的引物设计如下：

外套引物：上游引物P1  L5′-CAANTCACAACCCAAAACAAA-3′；

下游引物P2  L5′-CATTCACTTGGTCAAACACAGTC-3′；

内套引物：上游引物P1  L5′-CAANTCACAACCCAAAACAAA-3′；

下游引物P3  R5′-TTTTNACNATCACTGCTAGNGA-3′。

上述犬星状病毒的半套式RT-PCR检测方法具体包括以下步骤：

A、样品总RNA的提取

将样品悬浮于PBS溶液中，取200μl样品悬液上清通过一个孔径为0.45μl的过滤器进行过滤以除去真核、细菌大小的粒子，然后向样品悬液上清中加入1mL Trizol，室温静置10min，使核蛋白复合物完全变性；再加入200μl氯仿，剧烈震荡15s，在室温静置10min，后于4℃，12000rpm离心10min，取上清0.75mL转移到EP管中，加入0.75mL异丙醇，室温静置5-10min，后于4℃，12000rpm离心10min，移去上清，加入1mL75%酒精清洗沉淀，后于4℃7500rpm离心5min，弃去酒精，得到含有样品的总RNA的沉淀，将含有样品的总RNA的沉淀于室温干燥3-5min，加入30μl DEPC水。

B、cDNA的合成

采用试剂盒将总RNA逆转录成cDNA：提取的总RNA5μl、Anchored Oligo(dT)181μl、2×Reaction Buffer10μl、TransScript RT Enzyme Mix1μl和RNase-free Water3μl混匀，42℃孵育30min，85℃加热5min失活反转录酶，得到cDNA，置于-20℃备用。

C、PCR扩增

外套PCR扩增以1.0μl cDNA为模板，引物使用P1、P2，先95℃预变性5min；紧接着94℃40s、54℃30s、72℃40s，循环30次；再72℃延伸10min，4℃保存；内套PCR扩增以1.0μl外套PCR反应产物为模板，引物使用P1、P3，先95℃预变性5min；紧接着94℃40s、56℃30s、72℃40s，循环30次；再72℃延伸10min，得到PCR扩增产物，4℃保存。

D、电泳鉴定

取5μl PCR扩增产物，用1%琼脂糖凝胶电泳，紫外灯下观察扩增结果，与2000bp标准分子量对照，如在480bp处出现特异性扩增条带，则判定检测结果为阳性，否则为阴性。