[发明专利]大鼠真皮间质干细胞的培养方法

说明书

技术领域

本发明属于细胞的体外培养领域，更具体的，本发明涉及一种大鼠真皮间质干细胞的分离培养方法。

背景技术

真皮间质干细胞（dermal fibroblasts）作为皮肤的组织细胞，具有十分重要的生物学功能，主要体现在以下几个方面：①作为皮肤真皮的基质细胞对维持细胞外基质的平衡和稳定具有重要作用；②通过分泌细胞因子影响表皮的发育及生长；③调控毛囊等皮肤附属结构生长和再生；④可以作为间质干细胞的重要来源，移植修复其他组织器官。体外培养的真皮间质干细胞对研究皮肤发育过程中真皮和表皮间的相互作用及皮肤损伤再生具有重要意义。

现有的真皮间质干细胞细胞培养方法主要有两种：组织块的直接贴壁法和Dispase（中性蛋白酶）与胰酶消化法。

组织块贴壁法主要是通过将皮肤组织剪成1mm³的组织块，然后将组织块贴于培养皿中应用低糖DMEM，10%FBS培养液进行培养一定时间（有成纤维状细胞爬出生长即可），将生长的细胞进行消化，由于原代真皮胰酶消化时间比表皮角质细胞短，加入胰酶后先消化下来的细胞即为真皮间质干细胞，进行传代即可。此种方法是通过胰酶消化时间的不同区分真皮间质干细胞和角质细胞，分离培养得到的真皮间质干细胞混有表皮角质细胞，影响后续的实验研究。Dispase（中性蛋白酶）与胰酶消化法是将皮肤组织剪成细条状(宽度大约为：2mm，长约为：1cm)，将剪好的皮肤组织先用Dispase酶4℃消化过夜，将分离好的真皮组织剪碎后应用0.25%的胰酶消化30分钟，后将消化后的细胞800转每分钟离心5分钟，加入培养液种瓶传代。由于此种方法经过长时间的胰酶消化，使得到的真皮细胞的生长状态受到极大的影响，这样的细胞用于后续的实验研究得到的数据就会不稳定。

由此可见，目前真皮间质干细胞的培养方法存在弊端，而真皮间质干细胞在皮肤组织的发育和组织修复再生中具有重要作用，因此获得表皮细胞污染少状态又好的真皮间质干细胞培养方法的确立是非常必要的。

发明内容

基于此本专利提供了一种新的大鼠真皮间质干细胞的分离培养方法。

一种培养大鼠真皮间质干细胞的分离培养方法，包括取大鼠背部皮肤组织剪成细条状的步骤，然后将剪好的皮肤组织用0.25%的Dispase酶4℃冰箱中消化过夜；用含有双抗的PBS洗涤一遍，再将皮肤组织的真皮和表皮分开，将真皮组织放入含有双抗的PBS中洗涤一次后剪成1mm³的组织块；真皮组织块贴于细胞培养皿中倒置37℃培养箱中贴壁半小时，后应用低糖DMEM，10%FBS进行组织块的培养；真皮组织块培养48h到96h后即有成纤维状细胞爬出，当爬出细胞长满小皿即可进行胰酶常规消化传代培养得到真皮间质干细胞。

作为具体的实例，本发明包括以下步骤：

（1）将出生1-2天的大鼠乳鼠断颈处死，放入消毒酒精中浸泡5分钟，后在超净工作台中取出，无菌10cm大皿中PBS洗涤三次；

（2）将消毒酒精洗净的乳鼠背颈部的皮肤剪开，用眼科镊拽住头部和背部皮肤用力将皮肤组织撕下，将取好的背部皮肤放入含有青霉素和链霉素双抗的PBS中浸泡5分钟；

（3）将取好的背部皮肤组织剪成细条状(宽度大约为：2mm，长约为：1cm)，将剪好的皮肤组织用0.25%的Dispase酶4℃冰箱中消化过夜；

（4）将0.25%的Dispase酶消化过夜的皮肤组织块用含有双抗的PBS洗涤一遍，用眼科镊分别夹住皮肤组织的真皮和表皮（表皮相对较薄并成毛玻璃样）将两者分开，将真皮组织放入含有双抗的PBS中洗涤一次后剪成1mm³的组织块；

（5），将此步骤（4）中获得的真皮组织块贴于细胞培养皿（3.5cm小皿）中倒置37℃培养箱中贴壁半小时，后应用低糖DMEM，10%FBS进行组织块的培养；

（6）真皮组织块培养48h到96h后即有成纤维状细胞爬出，当爬出细胞长满小皿即可进行胰酶常规消化传代培养得到真皮间质干细胞。

在其中一个实例中，步骤（1）中应用乳鼠作为分离真皮间质干细胞的皮肤来源，利用乳鼠培养的原代的细胞状态和传代数量明显增加。

在其中一个实例中，步骤（3）中将皮肤组织剪成细条状(宽度大约为：2mm，长约为：1cm)，并且Dispase酶的浓度为0.25%，4℃冰箱中消化过夜效果最佳。