[发明专利]一种水溶性抗生素的分离纯化制备方法

说明书

技术领域

本发明属于生物防治技术领域，特别涉及一种水溶性抗生素的分离纯化制备方法，该方法制备的水溶性抗生素含有364和382两种分子量的分子结构。

背景技术

1994年Manker发现蜡状芽胞杆菌(Bacillus cereus，Bc)编号UW85的菌株能够生物合成抗生素，该抗生素水溶性极强，分子量为396，分子构成C₁₃H₂₈N₆O₈，分子结构如下：

；

上述抗生素分子具有线性氨基多元醇结构，该抗生素的英文名称为Zwittermicin A(简写ZwA)，即双效菌素。该抗生素对卵菌、藻类、原生生物和多种细菌及部分植物病原真菌均表现出一定的抑菌活性，具有广谱抗菌性。

目前苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis，Bt)是生产规模最大、应用最为成功的微生物杀虫剂，特有的杀虫晶体蛋白是天然杀虫剂，是最有利用前景的无公害生物农药。杀虫晶体蛋白的基因片段在转基因植物中广为利用，如抗虫棉等。虽然Bt有诸多优点，但它在田间应用时也存在防治效果不稳定、残效期短、杀虫速度慢、对某些目标害虫不敏感、容易使害虫产生抗药性等问题。因此，Bt杀虫晶体蛋白至今尚未在无公害蔬菜等绿色食品生产上发挥出应有的作用，但是该ZwA对Bt的晶体蛋白杀虫毒力具有增效作用，杀虫活性可以提高几倍到几千倍。

Bt与Bc类似也产生抗生素，该抗生素自身杀虫活性极低，因此，抗生素可作为增效因子来提高Bt的生物防治功效，从而减少Bt制剂的使用量，延缓害虫抗性的产生，拓宽杀虫谱。抗生素还具有抑制疫霉和腐霉的作用，当病原菌侵染植物前，可直接用抗生素喷雾，达到防治植物病害的目的。因此，ZwA作为一种新型的抗生素，具有很高的研究价值和潜在的应用价值。

1994年发现的ZwA抗生素分子量是396，来自于蜡状芽胞杆菌；其次，过去文章、专利、成果涉及到了Bc和Bt的ZwA抗生素分子量都是396，没有涉及到其它分子量的ZwA抗生素。

我们首次从国际通用编号HD-1或写为HD1的Bt菌株发酵液中发现分子量364和382两个水溶性ZwA抗生素，写为ZwA₃₆₄和ZwA₃₈₂。以示与以往396分子量ZwA₃₉₆抗生素相区别。ZwA₃₆₄和ZwA₃₈₂与ZwA₃₉₆相比较，除了分子量有所差异之外，在抑菌性、茚三酮比色法检测等方面相同，它们属于共同的ZwA抗生素家族。

早在1969年Bt的HD-1菌株被筛选出来，世界上许多学者研究过该菌株，但是由于种种原因一直以为该菌株产生ZwA₃₉₆抗生素。

本申请将公开HD-1或写为HD1的发酵液中的364和382分子量的两个水溶性ZwA₃₆₄和ZwA₃₈₂抗生素的发现及其纯化制备方法。

发明内容

本发明的目的是提供一种水溶性抗生素的分离纯化制备方法。

整套方法由九大步骤组成，缺一不可，并且要按照以下九大步骤的顺序进行。包括：(1)制备培养基；(2)制备发酵种子菌液；(3)扩大发酵的条件；(4)抗生素ZwA的第一次纯化萃取法；(5)抗生素ZwA的第二次纯化大孔树脂法；(6)抗生素ZwA的第三次纯化硅胶层析法；(7)高效液相色谱法纯度检测；(8)质谱法分子量定性分析；(9)结论。

具体步骤为：

(1)制备培养基

1.1斜面培养基：牛肉膏3-6g，蛋白胨5-15g，氯化钠3-7g，琼脂粉10-20g，pH7.0-7.2，定容至1L，121℃灭菌30min备用。

1.2菌株HD-1种子培养基：酵母膏3-7g，蚕蛹蛋白膏5-15 g，氯化钠5-15 g，pH7.0-7.2，定容至1L，121℃灭菌30min备用。

1.3初始发酵培养基：葡萄糖10-30g，蚕蛹蛋白膏10-30g，CaCL₂ 0.05-0.10g，K₂HPO₄ 1-2g，MgSO₄ 0.1-0.3g，MnSO₄ 0.05-0.1g，pH 7.0-7.2，定容至1L，121℃灭菌30min备用。