[发明专利]靶向性抗肿瘤融合蛋白质LPO的新型制备工艺

说明书

技术领域

本发明涉及基因工程领域，具体地说是靶向性抗肿瘤融合蛋白质LPO的新型制备工艺。

背景技术

恶性肿瘤（癌症）业已成为人类生命的最大杀手。世界卫生组织最新研究数据显示，到2020年全球癌症发病率将增加50%，即每年将新增1500万癌症患者。不仅如此，癌症的死亡人数也在全球迅猛上升。2007年全球有760万人死于癌症，预计2030年这个数字将会增加到1320万，据国家卫生部发布的权威报告称我国新发癌症和因癌症死亡病例数分别占全球的20%和24%。所以，恶性肿瘤的治疗成为当今医学的重要任务之一。

  核糖核酸酶(RNase)普遍存在于自然环境和人体内，它们可以通过降解细胞内的核糖核酸而杀死细胞。肝脏细胞内大约含 20余种核酸内切酶和外切酶，它们参与 RNA代谢、细胞成熟及凋亡、促进新生血管形成、主动防御 RNA病毒等生物学作用。尽管核糖核酸酶大量存在，但由于核糖核酸酶抑制剂(RI)的抑制作用，体内的RNase并未对组织细胞造成伤害。

RNase A超家族主要成员有 RNase A、人胰脏核糖核酸酶、嗜曙红细胞衍生神经毒素、嗜曙红阳离子蛋白、血管生成因子、牛精液核糖核酸酶和两栖类核糖核酸酶（如豹蛙酶和牛蛙凝集素）等。RNase A超家族通过降解 RNA发挥作用，其家族成员具有相似的氨基酸序列和三级结构，一般含有 4对二硫键（血管生成因子含有 3对二硫键），并且都含有相同的催化三联体，包括 2个组氨酸和 1个赖氨酸。由于该家族的许多成员来源于人或哺乳动物，它们的免疫原性要比来源于植物或微生物的毒素复合物低。

在十九世纪70年代时，Shogen和Yoon最先在北极豹蛙的胚胎内分离提出一些带有抗癌活性的提取物。于1987年，提取物的主要活性成分被Alfacell M分离并且纯化出来。那些活性物质是一种小的（大约12kDa）母性起源（目前大量存在于未受精的卵母细胞中）的碱性蛋白。被称为豹蛙酶（ranpimase），后来正式命名为Onconase（简称ONC），它由 104个氨基酸残基组成，相对分子质量为 11835Da，等电点为 9.7，其序列与胰脏核糖核酸酶A（RNase A，EC 3.1.27.5）和核糖核酸酶超A家族的其他成员十分的相似，与RNase A有30%的碱基序列同源，并且三级结构相似，是已知的胰核糖核酸酶超家族成员中最小的单结构域蛋白。单就核糖核酸酶活性而言，RNase A要高于豹蛙酶和牛精液核糖核酸酶(BS-RNase)，但由于受到 RI的抑制，RNase A对肿瘤细胞没有杀伤效果；两栖类动物体内的 RNase A由于可以避开 RI，故有杀伤肿瘤细胞作用。尤其是豹蛙酶，是首个进入Ⅲ期临床研究的核糖核酸酶类药物，主要用于治疗恶性间皮瘤，目前治疗非小细胞肺癌的研究也已经进入了临床Ⅱ期试验阶段。

ONC与已知的RNase A结构相似，由 2个反向平行的 β片层和 3个 α螺旋结构组成了的肾形核结构，其酶活性中心是一个保守的催化三联体。Robert F. Gahl等人在试验中发现ONC氧化折叠过程中会形成稳定的中间体，这样可以保持它的有效活性形式。Daniel E. Holloway等报告了在100K电场和复杂硫酸根离子中， ONC的晶体结构，在一个质量足够大的电子密度图中明显的显示出了几个非平面的肽键，可以非常容易确定其活性中心的大多数残基。

为了确定ONC蛋白质中负责毒性的氨基酸残基，You-Di Liao等人从染色体组克隆豹蛙的rpr基因，并在大肠杆菌BL21（DE3）中进行了多种形式的表达 。表达方法一：将甲硫氨酸排列在ONC重组体的N-末端，结果发现该重组蛋白热稳定性减小且催化活性和抗原性降低。他们利用依赖内源性大肠杆菌甲硫氨酸氨基肽酶和apelB信号肽切割两种方式生产了没有甲硫氨酸的ONC，发现重组蛋白与天然来源的ONC的物理、化学、生物特性基本相符。同时证明在ONC 的N-末端具有尿苷-鸟嘌呤底物偏爱性的焦谷氨酸，完整且外露的N-末端焦谷氨酸对豹蛙酶的细胞毒性有较大的帮助作用。