[发明专利]水稻黑条矮缩病毒RNAi多价靶基因序列及应用

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别涉及利用RNAi介导技术构建抗水稻黑条矮缩病毒载体的方法及应用。 

背景技术

水稻黑条矮缩病毒（Rice black-streaked dwarf virus，RBSDV）隶属呼肠孤病毒（Reoviridae）科斐济病毒（Fijivirus）属，主要由灰飞虱（Laodelphax striatellus fallen）以持久性不经卵方式传播（Milne and Lovisolo,1977;Azuhata et al.,1993)。该病毒主要引起水稻黑条矮缩病和玉米粗缩病，可侵染水稻、大麦、小麦、玉米等禾本科植物。RBSDV于20世纪40年代首先在日本发现，之后在20世纪60年代和90年代在我国华北、华东等地大规模流行，造成严重的经济损失(徐秋芳等，2012)。近年来，RBSDV危害成逐年加重趋势，造成了严重的经济损失。该病在江苏省2007年的发生面积为2.0×10⁴hm²，至2008年迅速上升至2.6×10⁵hm²，2009年则发展到约3.3×10⁵hm²(季英华等，2009)。RBSDV在我国引起了的病害日益严重，给我国的粮食安全带来了严峻的挑战，如何控制并降低RBSDV的危害已是一个极具现实意义的问题。选育和推广抗病品种是防治水稻病毒病最经济、有效的方法，但存在抗性资源缺乏、育种周期长、效率低等问题，因此，充分利用各种分子手段有利于加速水稻抗病育种的进程。 

随着近年来RNA干扰(RNA interference，RNAi)机制研究的不断深入，利用RNAi的高效性和特异性来控制植物的病毒病已开始得到重视和应用(Cogoni and Macino,2000)。1998年waterhouse等（Waterhouseet et al.,1998)首次报导了利用RNAi技术防治马铃薯Y病毒。Shimizu等（Shimizuet et al.,2009)利用RNAi沉默了水稻矮缩病毒(RDV)的pns12基因，获得了具有RDV抗性的转基因水稻。因此，采用RNAi技术培育抗病毒植物具有高度可行性。 

RBSDV含有10条双链RNA（S1-S10），目前已知RBSDV多个分离物的基因组全序列，而且部分编码蛋白的功能已得到初步验证。如S8编码的蛋白P8为最小的结构蛋白，P8进入寄主并在病毒与寄主互作过程中对寄主基因的表达起负调控的作用(Li et al.,2007)；S10编码蛋白（63.3kDa）为病毒粒子的外层衣壳蛋白（Liu et al.,2007）；S4可编码结构蛋白B-突起（Zhang et al.,2001）。 

发明内容

本发明所解决的技术问题是提供一种优选的水稻黑条矮缩病毒RNAi多价靶基因序列，所述基因序列是特定选取了水稻黑条矮缩病毒RBSDV的S8、S10、S4编码区基因序列的组合，设计构建了抗RBSDV的多价RNA沉默载体，通过试验证明了其转化后具有很好的抗病毒活性。 

本发明的技术方案是：一种水稻黑条矮缩病毒RNAi多价靶基因序列，依次包括水稻黑条矮缩病毒S8编码区的206bp片段，对应S8基因30～131bp，1015～1118bp；和S10编码区的205bp，对应S10基因的433～637bp；和S4编码区的203bp，对应S4基因的2218～2420bp；在S8的5’端加入BamH1酶切位点和CCG三个保护碱基，在S4的3’端加入XhoI酶切位点和ACA三个保护碱基。 

优化后的水稻黑条矮缩病毒RNAi多价靶基因序列如SEQ ID NO.1所示。 

本发明的RNAi靶序列，可以克隆并构建到RNAi中间载体中，进而获得RNA沉默载体，然后再通过农杆菌转化法转到植物植株中。所述中间载体可以为tENTRA-S8+S10+S4，也可以为其他已知的载体；获得的多价RNA沉默载体为pBDL03-S8+S10+S4。 

只要含有本发明的水稻黑条矮缩病毒RNAi多价靶基因序列的载体都可以应用于转基因植物的培育中，用于防治水稻黑条矮缩病毒病。植物优选为水稻，也可以为其他同源性高的植物植株。