[发明专利]维氏气单胞菌的LAMP检测引物组和试剂盒

说明书

技术领域

本发明属于维氏气单胞菌检测技术领域，具体涉及维氏气单胞菌的LAMP检测引物组和试剂盒。

背景技术

维氏气单胞菌(Aeromonas veronii，AV)又称维罗纳气单胞菌、凡隆气单胞菌和维隆气单胞菌，广泛分布于人的食物链、水体环境和泥土中。可以通过饮水、皮肤创伤等途径感染动物机体，并在体内经过不同途径对机体器官进行破坏，引起人类食物中毒、脑膜炎和败血症等，同时，也能感染中华鳖、中华绒螯蟹、泥鳅、锦鲤、斑点叉尾鮰等水产动物，并引起大量死亡，是一种新的人-畜-鱼共患病的病原体，给人类健康带来危害，也给水产养殖业造成重大的经济损失。部分国家已经将其规定为食品安全的检疫对象。因此，建立灵敏、准确、快捷、方便的维氏气单胞菌检测方法是减少维氏气单胞菌的发生和危害的重要途径。

目前维氏气单胞菌的检测方法主要是生化鉴定和普通PCR方法，但是，前者费时费力、检测样品量少、人为差异大、准确率低，尤其在鉴定到种的水平上，比较困难，完全确诊需要1-3周时间，远不能满足日常快速检测工作的需要，后者仪器设备贵、操作步骤多、人员要求高，而且灵敏度受一对引物的局限而使准确度受到一定的影响，不适合基层单位及现场的快速检测。目前病原检测方法正向更特异、更快速、费用低廉化的方向发展。建立检测维氏气单胞菌快速准确的方法，是食品卫生检测和水产养殖传染病检测的需要。

环介导等温扩增（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）是日本学者NOTOMI等于2000年开发的一种新的恒温核酸扩增技术，其特点是针对靶基因的6（或8）个区域设计4（或6）种特异引物，利用链置换DNA聚合酶（Bst DNA polymerase）在65℃左右的恒温条件下，保温几十分钟，即可完成核酸扩增反应。不需要模板的热变性、长时间温度循环、电泳等过程，基因的扩增及产物检测可一步完成，扩增效率高，能在60min内扩增10⁹-10¹⁰倍，该技术具有高特异性、高效性、快速、简便、易检测、不需要特殊仪器等特点，LAMP反应中可形成明显的白色焦磷酸镁沉淀，可通过对浊度的观察或加入荧光染料，直接通过颜色变化来判定反应结果。该技术具有高特异性、高效性、快速、简便、易检测等特点，已广泛应用于细菌、细菌、寄生虫、转基因作物领域的检测，并取得了较理想的效果。但是迄今为止，市场上还未见用于检测维氏气单胞菌的LAMP检测引物及试剂盒问世。

发明内容

本发明的目的在于提供一种维氏气单胞菌的LAMP检测引物组，该引物组特异性强，灵敏度高。

本发明的目的还在于提供一种维氏气单胞菌的LAMP检测试剂盒，该试剂盒灵敏度高，快速，简便，成本低。

本发明的第一个目的是通过如下技术方案来实现的：一种维氏气单胞菌的LAMP检测引物组，包括一对外引物AV-F3和AV-B3，一对内引物AV-FIP和AV-BIP，以及一对环引物AV-LF和AV-LB，其中AV-F3的核苷酸序列如SEQ ID NO.1中所示，AV-B3的核苷酸序列如SEQ ID NO.2中所示，AV-FIP的核苷酸序列如SEQ ID NO.3中所示，AV-BIP的核苷酸序列如SEQ ID NO.4中所示，AV-LF的核苷酸序列如SEQ ID NO.5中所示，AV-LB的核苷酸序列如SEQ ID NO.6中所示。

各引物具体的核苷酸序列分别如下所示：

AV-F3：GGGTTGTGGAGCAACAAA（SEQ ID NO:1）；

AV-B3：AGATCGTCCTCGTCATCTT（SEQ ID NO:2）；

AV-FIP：GCTGTCGAAGGCATCACGACCGATCAAAGAGAAACCGAT（SEQ ID NO:3）；

AV-BIP：GATGGCATCGGCCAGGTACGAGTTCCGGCTCTTCACT（SEQ ID NO:4）；

AV-LF：CGACTTGGAGTCCATCCG（SEQ ID NO:5）；

AV-LB：GTGTGGTCAGTGGTCGTC（SEQ ID NO:6）。

本发明根据维氏气单胞菌（AV）的细胞分裂蛋白基因（zipA基因，Genbank登录号为JN830283.1）设计了上述六条特异性引物，应用上述六条引物，能特异性识别靶序列8个位点，保证了核酸扩增高度特异性，即LANMP能从相差仅一个核苷酸的基因标本中找出相应的靶序列进行扩增，因此其特异性极高。