[发明专利]一种应用南极假丝酵母脂肪酶B生产替卡格雷手性药物中间体的方法

说明书

技术领域

本发明属于酶工程技术领域，具体涉及一种应用CALB拆分具有（a）所示结构式的外消旋替卡格雷中间体，其中R=C_nH_2n+1CO或C_nH_2n-1CO(n=2～6)，R’=Cbz或Boc，经转化后获得单一构型的中间体（b）的方法。

R=C_nH_2n+1CO或C_nH_2n-1CO(n=2～6)，R’=Cbz或Boc

R’=Cbz或Boc

背景技术

（1S,4R）4-氨基-2-环戊烯-1-醇可作为替卡格雷关键手性中间体。

Mark J.Mulvihill（Enzymatic Resolution of Aminocyclopentenols as Precursors to D-and L-Carbocyclic Nucleosides,J.Org.Chem,1998）报道了采用南极假丝酵母脂肪酶B催化外消旋cbz或Boc基团保护的4-氨基-2-环戊烯-1-醇，生产构型为（1S，4R）的对应乙酰产物的酰化反应，其获得的（1S，4R）乙酰化产物纯度较低，ee值仅为90%，且消耗的CALB酶量较多。此外，暂未有其他采用生物催化法生产（1S,4R）4-氨基-2-环戊烯-1-醇的报道。本发明中公开了一种利用南极假丝酵母脂肪酶B生产（1S,4R）N-苄氧羰基-4-氨基-2-环戊烯-1-醇或（1S,4R）N-叔丁氧羰基-4-氨基-2-环戊烯-1-醇的方法，催化效率高，获得的产物纯度高，因此该发明具有非常重要的应用价值。

发明内容

本发明需要解决的技术问题是提供一种应用CALB拆分具有（a）所示结构式的外消旋替卡格雷中间体，其中R=C_nH_2n+1CO或C_nH_2n-1CO(n=2～6)，R’=Cbz或Boc，获得单一构型中间体（b）的方法。

R=C_nH_2n+1CO或C_nH_2n-1CO(n=2～6)，R’=Cbz或Boc

R’=Cbz或Boc

本发明的目的是通过以下技术方案实现的：

一种以CALB为生物催化剂转化生产（1S,4R）N-苄氧羰基-4-氨基-2-环戊烯-1-醇或（1S,4R）N-叔丁氧羰基-4-氨基-2-环戊烯-1-醇的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：

（1）生物催化剂选择：选用南极假丝酵母脂肪酶B（CALB）为生物催化剂；

（2）将南极假丝酵母脂肪酶B溶于通用缓冲液中，再与消旋体底物（a）混合，得到混合液；将所述的混合液在一定温度下进行转化，得到反应液；

（3）样品萃取：向反应液中加入有机溶剂，进行振荡混合后，离心分离，得化合物（b）；本发明用于转化生产产物（b）的酶是一种从南极假丝酵母中获取的脂肪酶B，可通过基因克隆表达或购买获得；

所述的南极假丝酵母通过基因克隆表达，具有如下性质：

1、采用的培养基：

A、固体培养基：胰蛋白胨4g，酪蛋白胨2g，酵母膏2g，牛肉膏1.5g，葡萄糖1g，琼脂20g，蒸馏水1000ml。

B、种子培养基：葡萄糖8g，K₂HPO₄1g，MgSO₄1g，酵母膏2g，蒸馏水1000ml。

C、液体发酵培养基：豆粉40g，K₂HPO₄4g，MgSO₄1g，酵母膏5g，豆油5ml，吐温-801ml，蒸馏水1000ml。

2、培养条件：

A、培养温度：25～30℃，最适温度：30℃。

B、培养方式：有氧条件下振荡培养。

C、培养时间：2～3天。

所述的通用缓冲液为三羟甲基氨基甲烷（Tris）50mM；硼酸50mM；柠檬酸33mM；Na₃PO₄50mM，用HCl或NaOH调pH3～12，优选pH5。

步骤（2）所述的混合液中CALB酶浓度为0.04～1mg/ml，优选0.08mg/ml。所述的混合液中消旋体底物浓度为1g/L～100g/L，优选20g/L。