[发明专利]温和气单胞菌的LAMP检测引物组及试剂盒

说明书

技术领域

本发明属于温和气单胞菌检测技术领域，具体涉及一种温和气单胞菌的LAMP检测引物组及试剂盒。

背景技术

温和气单胞菌（Aeromonas sobria，AS）隶属于弧菌科，气单胞菌属，为革兰氏阴性杆菌。广泛分布于淡水、污水、土壤以及人的食物链，是水产养殖中危害较大的致病菌之一，此病常暴发流行，死亡率高，能引起出血性败血症，主要危害中华鳖、巴西龟、罗非鱼、鲤鱼、黄鳝、鳗鲡、泥鳅、蟹。同时也可以通过被污染的水产品、畜禽肉类和水源等途径感染人，引发患者出现急性腹泻，也可能引起脑膜炎、脓毒性关节炎和败血症。不仅给养殖业造成严重的经济损失，同时给人类健康带来危害，是一种重要的人-畜-鱼共患病的病原体。国内外学者普遍认为，早发现疾病并采取诸多措施阻止细菌传播，是综合预防有效的方法。因此，建立灵敏、准确、快捷、方便的温和气单胞菌检测方法是减少温和气单胞菌发生和危害的重要途径。

目前温和气单胞菌的检测方法主要有生化检验法和分子生物学方法等。由于气单胞菌的生化性状上极为相似，在常规诊断上需通过生化检验排除其它种，检验方法步骤繁琐、需要鉴定的生化反应数目多，耗时长，且易造成结果不准确，特别是鉴定到种的水平，尤为困难，其特异性和灵敏度低，远不能满足日常快速检测工作的需要。PCR技术自问世以来，凭借灵敏、特异、快速等优点，被普遍应用于水产养殖病原的检测中。但PCR技术对实验人员和环境的要求高，仪器设备复杂、操作步骤多。与一般PCR技术相比，荧光PCR检测技术简化了操作步骤，而且可消除扩增产物引起的交叉污染，减少假阳性的发生。但实时荧光PCR的仪器设备昂贵，使用成本较高，无法满足现场检测需要。目前检测方法正向更特异、更快速、更便捷、定量化、费用低廉化的方向发展。因此，建立检测温和气单胞菌快速准确的方法，对促进中国水产养殖、水产品安全及口岸检疫有重要作用。

环介导等温扩增（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）是NOTOMI等建立的一种新的核酸扩增技术，其特点是针对靶基因的6（或8）个区域设计4（或6）种特异引物，利用链置换DNA聚合酶（Bst DNA polymerase），在60～65℃的恒温条件下，历时几十分钟，即可完成核酸扩增反应，不需要模板的热变性、长时间温度循环、电泳等过程，基因的扩增及产物检测可一步完成。LAMP反应中可形成明显的白色焦磷酸镁沉淀，可通过对浊度的观察或加入荧光染料，直接通过颜色变化来判定反应结果。该技术具有高特异性、高效性、快速、简便、易检测等特点，适合基层推广检测，符合疾病检测的快速、准确的诊断需要，已广泛应用于细菌、病毒、寄生虫等病原体的检测研究，并取得了较理想的效果。但是迄今为止，市场上还未见用于检测温和气单胞菌的LAMP检测引物及试剂盒问世。

发明内容

本发明的目的在于提供一种温和气单胞菌的LAMP检测引物组，该引物组特异性强，灵敏度高。

本发明的目的还在于提供一种温和气单胞菌的LAMP检测试剂盒，该试剂盒灵敏度高，快速，简便，成本低。

本发明的第一个目的是通过如下技术方案来实现的：一种温和气单胞菌的LAMP检测引物组，包括一对外引物AS-F3和AS-B3，一对内引物AS-FIP和AS-BIP，以及一对环引物AS-LF和AS-LB，其中AS-F3的核苷酸序列如SEQ ID NO.1中所示，AS-B3的核苷酸序列如SEQ ID NO.2中所示，AS-FIP的核苷酸序列如SEQ ID NO.3中所示，AS-BIP的核苷酸序列如SEQ ID NO.4中所示，AS-LF的核苷酸序列如SEQ ID NO.5中所示，AS-LB的核苷酸序列如SEQ ID NO.6中所示。

各引物具体的核苷酸序列分别如下所示：

AS-F3：CGGACGAATGGACTCGAA（SEQ ID NO:1）。

AS-B3：AAGCTCTGGCAGAGGCTC（SEQ ID NO:2）。

AS-FIP：AACGCAGGAGTGGCACGATTTGACAGCGATGGCATC（SEQ ID NO:3）。

AS-BIP:GAAGACGAGGAAGAGGATCTGCAATTCGTCTTCCTGATAGACAG（SEQ ID NO:4）。

AS-LF：AGCGAGTTCCGGCTCTTC（SEQ ID NO:5）。

AS-LB：CACTTCGCAAGCCTGCTG（SEQ ID NO:6）。