[发明专利]白芷花药诱导成苗培养方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种植物的花药培养方法，具体为白芷花药诱导成苗培养方法。

背景技术

白芷为伞形科当归属植物白芷Angelica dahurica(Fisch.ex Hoffm.)Benth.et Hook.f.或杭白芷A.dahurica(Fisch.ex Hoffm.)Benth.et Hook.f.var.formosana(Boiss.)Shan et Yuan，叶互生，根粗长，圆锥形，有浓烈香气。基生叶一回羽状分裂，有长柄，叶柄下部有管状抱茎、边缘膜质的叶鞘；株高可达2.5m，复伞形花序顶生或腋生，伞幅18～40cm，花白色。花期7～8月，果期8～9月，主要以种子繁殖。其干燥根性辛，温，归胃、大肠、肺经，列为中品。具有解表散寒，祛风止痛，宣通鼻窍，燥湿止带，消肿排脓。作为常用大宗类药材，其入药历史悠久，至少已有2000多年。

利用花药培养诱导产生单倍体，经染色体加倍可获得纯合二倍体，从而获得一些优良的纯合自交系，进而利用杂种优势可选育出具有更多优良性状的白芷新品种(组合)。此育种方法能快速获得纯合正常植株，能明显缩短育种年限。

目前已报道的白芷花药培养方法中，需要在白芷花药培养形成愈伤组织后，进一步添加硝酸银等，才有少量的出芽率，这种添加硝酸银的方法不但有重金属残留，而且出苗数量极少、苗弱不易成活；其适用的白芷品种也有限，如我们利用其方法培养白芷新品种“川芷2号”的花药，发现其愈伤组织即使添加硝酸银也完全不能再分化形成完整植株，生产上急需更适宜的白芷花药培养技术。

发明内容

本发明的目的在于克服现有白芷花药培养技术存在的缺陷，得到一种能够通过白芷花药培养成苗的组培方法，为白芷花药培养提供了一种效率高、成活率高的方法，在短期内迅速获得大量健壮、安全、生活力强的白芷花药植株。

本发明的目的可以通过以下技术方案来实现，白芷花药诱导成苗培养方法，该方法包括以下步骤：

(1)花药采集

白芷开花初期，采集花粉生长在单核靠边期的白芷花序；

(2)温度预处理

采集到的白芷花序，进行温度预处理；

(3)消毒灭菌

取温度预处理过的白芷花序流水冲洗30-40min，在超净工作台上用75％酒精处理30s后再用0.1％升汞浸泡10-15min，倒掉升汞溶液，用无菌水漂洗5次，每次4-5min，用无菌干燥滤纸吸干花序表面水分备用；

(4)诱导愈伤及成苗

在超净工作台上，以无菌挑针从灭过菌的白芷花序中挑取花药接种到愈伤组织诱导培养基上，暗培养到愈伤组织形成，接着光培养至分化开始形成丛生芽；

(5)壮苗

将上一步所得的白芷丛生芽、带芽点的愈伤组织在无菌条件下转接到壮苗培养基上进行培养成独立的健壮植株；

(6)生根培养

将上一步所得无菌苗转移到生根培养基中进行生根培养，直至形成完整植株；

(7)炼苗与移栽

将上述获得完整植株的无菌瓶，室温条件下打开瓶盖添加30-50ml无菌水，每天喷施稀释2000倍的MS微量元素4-5次，5-6天后将苗取出，洗净根部培养基即刻移栽到浇透水的营养土中，1200LX光照，25+1℃光照培养箱中炼苗，每天继续喷施稀释2000倍MS微量元素3-4次，足月后移栽到大田。

其中，第(1)步骤花药采集，是在晴朗天气的上午8点至10点，取生长健康的白芷植株上大小不同的花蕾，通过镜检观察，确认花粉处于小孢子单核靠边期时对应的花蕾和花药外部形态，采集大量具该花蕾和花药外部形态的花序。

第(2)步骤温度预处理，处理条件为32℃热激处理0-5天，或者，处理条件为4℃低温预处理时间0-7天，遮光保存。温度预处理条件优选为：32℃热激处理12h，或4℃低温预处理5天。

关于培养基，其中愈伤组织诱导培养基包括：MS+苄基腺嘌呤6-BA1.5-2.5mg／L+α-萘乙酸NAA1-2mg／L+3％蔗糖；愈伤组织诱导培养基成分优选为：MS+苄基腺嘌呤6-BA1.5mg／L+α-萘乙酸NAA1mg／L+3％蔗糖；

壮苗培养基包括：MS+苄基腺嘌呤6-BA0.5-2mg／L+α-萘乙酸NAA0.5-2mg／L+5-20mg／L矮壮素+3％蔗糖；壮苗培养基成分优选为：MS+苄基腺嘌呤6-BA2mg／L+α-萘乙酸NAA0.5mg／L+5mg／L矮壮素+3％蔗糖；