[发明专利]一种重组家蚕素的表达方法及其抗肿瘤应用

权利要求书

1.一种重组家蚕素的表达方法，其特征在于，制备方法包括以下步骤：

（1）优化家蚕素基因：根据表达系统对删除编码信号肽序列基因的家蚕素基因进行密码子偏好优化，添加酶切位点和纯化标签，人工合成基因片段；

（2）构建重组克隆载体：将步骤（1）中的人工合成基因片段与克隆载体连接，转化到大肠杆菌中，挑选阳性克隆；

（3）构建重组表达载体：将表达载体和步骤（2）重组克隆载体分别酶切、纯化、回收目的基因片段和线性化表达载体、连接目的基因片段和线性化表达载体，构建重组表达载体，将重组表达载体转化到酵母菌中，经筛选得到酵母菌转化子；

（4）表达重组家蚕素：对步骤（3）所筛选的转化子进行培养、诱导、分离、纯化，得到重组的家蚕素。

2.根据权利要求1所述的一种重组家蚕素的表达方法，其特征在于，步骤（1）中所述家蚕素基因为bbxA6，优化后的家蚕素基因bbxA6的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

3.根据权利要求1所述一种重组家蚕素的表达方法，其特征在于，步骤（3）中所述的表达载体为pPIC9、pPIC9k、pHIL-S1、pPICza、pYAM75P6、pHIL-D2、pA0815、pPIC3K、pPICZ、pHWO10、pGAPZ、pGAPZa、pYES2、pYES2/NT、pYES2/CT、pYES3，pYES6、pYCplac22-GFP、pAUR123、pRS303TEF、pRS304、pRS305、pRS306、pY13TEF、pY14TEF、pY15TEF、pY16TEF、pSH47、pHISi，pLacZi、pHIS2或pGAD42。

4.根据权利要求1所述一种重组家蚕素的表达方法，其特征在于，步骤（3）中所述的酵母菌为毕赤酵母菌GS115。

5.根据权利要求1所述的一种重组家蚕素的表达方法，其特征在于，步骤（4）所述的重组的家蚕素为家蚕素II。

6.一种重组家蚕素的表达方法，其特征在于，制备方法包括以下步骤：

（1）优化家蚕素基因：根据表达系统对家蚕素基因进行密码子偏好优化，添加酶切位点和纯化标签，人工合成基因片段；

（2）构建重组克隆载体：将将步骤（1）中的人工合成基因片段与克隆载体连接，转化到大肠杆菌中，挑选阳性克隆；

（3）构建重组表达载体：将表达载体和步骤（2）重组克隆载体分别酶切、纯化、回收目的基因片段和线性化表达载体、连接目的基因片段和线性化表达载体，构建重组表达载体，将重组表达载体转化到大肠杆菌菌中，经筛选得到大肠杆菌转化子；

（4）表达重组家蚕素：将步骤（3）所筛选的大肠杆菌转化子培养、诱导、分离、纯化得到重组的家蚕素。

7.根据权利要求6所述的一种重组家蚕素的表达方法，其特征在于，步骤（1）中所述家蚕素基因为bbxE1，优化后的家蚕素基因bbxE1的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。

8.根据权利要求6所述一种重组家蚕素的表达方法，其特征在于，步骤（3）中所述的表达载体为pGEX-5X-1、pET3a、pET-11a、pET-12a、pET-14b、pET-15b、pET-16b、pET-17b、pET-19b、pET-20b、pET-21a、pET-22b、pET-23a、pET-23b、pET-24a、pET-25b、pET-26b、pET-27b、pET-28a、pET-29a、pET-30a、pET302,-303、pET-31b、pET-32a、pET-35b、pET-38b、pET-39b/pET-40b、pET-41a,-b、pET-42a、pET-43.1a,-b、pET-44a、pET-49b、PET303、pET-His、pET-Dsb、pET-GST、pET-Trx、pQE2、pQE9、pQE30,31,32、pQE-40、pQE70、pQE80L或pQETirs-system。

9.根据权利要求6所述一种重组家蚕素的表达方法，其特征在于，步骤（3）中所述的大肠杆菌为大肠杆菌BL21。

10.根据权利要求6所述的一种重组家蚕素的表达方法，其特征在于，步骤（4）所述的重组的家蚕素为家蚕素IV。

11.根据权利要求1或6重组家蚕素的表达方法制备的家蚕素。