[发明专利]尿液细菌检测毛细管芯片及测定试剂

说明书

技术领域

本发明涉及利用毛细管芯片检测技术，化验尿液中细菌和数量的毛细管芯片。体现在本发明设计了一种毛细管芯片，同时含有测定尿液中细菌的试剂与技术。 

技术背景

毛细管电泳（CapillaryElectrophoresic,CE）又称高效毛细管电泳（High PerformanceCapillaryElectrophoresic,HPCE）或毛细管分离电泳（CESM），是以毛细管为分离通道，电子或荷电离子以高压直流电场为驱动力，在毛细管中按照淌度或/和分配系数不同进行分离的一种的液相分离技术。毛细管电泳已经应用于糖类化合物的分离、氨基酸对映体的拆分、蛋白质、多肽分析、寡核苷酸的分离、DNA测序等多种类型生物分子物质的分离和分析研究。发展逐渐趋势是应用于细胞分析与研究。 

毛细管芯片是在毛细管电泳的原理和技术的基础上，利用微加工技术，在平方厘米大小的芯片之上，加工出实现各种功能的微细结构。例如：根据功能区域设计毛细管通道和其它的功能单元，通过不同的毛细管通道、反应器、检测单元和特定的布局，实现样品的进样、生物反应、分离和检测功能。是一种多功能化的快速、高效和低耗的微型实验装置。已经应用于研究，特定基因及表达蛋白质与疾病之间的关系、疾病诊断、药物治疗靶点筛选、细胞定位、抗体药物筛选等相关学科。 

Jorgenson和Lukecs于1981年使用75nm内经的熔融毛细管，采用电迁 移进样和高灵敏的荧光检测，在30KV电压下产生的理论塔板数达到4×10⁵/m，这样良好的柱效标志高效毛细管电泳成为分离技术领域一个里程碑性的标志。目前，国内外HPCE研究的发展趋势侧重于应用研究，成果体现在发现新型分离模式以及多种检测方法之间联合进行检测等，在技术方面发展迅速。 

毛细管芯片材料,毛细管芯片的基础材料有石英、玻璃、硅片、高分子聚合物、陶瓷、硅橡胶等多种材料，其中玻璃是目前使用较多的芯片材料，成功应用主要与其所具有的良好光学性质、散热性和绝缘性以及已经研究透彻的表面性质。在过去40年这些材料的微加工方法在微电子领域得到了成熟发展。毛细管电泳芯片（IntegratedCapillaryElectrophoresis，ICE）技术是半导体的微制造技术基础之上发展起来。以玻璃为基片的毛细管电泳芯片制造过程，一般经过沉积、光刻、刻蚀和键合，四步制备工艺。虽然采用干法刻蚀可以在玻璃上获得高深度的微管，但是如果管道表面比较粗糙，可导致降低电泳的分辨率。 

2009年12月2日公开，丁桂浦的“毛细管电泳芯片制备方法”，专利号200910053745.3，公布了一种微细加工毛细管电泳芯片的方法，具体步骤包括：制备第一粘附-种子层；甩第一光刻胶、烘胶、光刻支撑立柱的结构图形；在支撑立柱的结构图形的空腔内电镀支撑立柱；制备第二粘附-种子层；甩第二光刻胶，烘胶，光刻毛细管电泳芯片图形；在毛细管电泳芯片图形空腔内电镀；依次去除第二层光刻胶、第二粘附-种子层，得到悬空的金属管网状结构；以金属管网状结构为阴极，惰性金属为阳极，将二者浸入阴极电泳液中，通电，得到被薄膜包裹的金属管网状结构；在薄膜上开出两孔，然后将被薄膜包裹的金属管网状结构烧结，腐蚀，即可获得毛细管芯片。依据上述技术 可以批量、单量制备精度毛细管芯片。 

尿液中含有细胞、细菌、盐类结晶等有形成分，统称为尿沉渣(Urinary Sediment)成分，早在17世纪Rayer等将检测尿液有形成分应用于临床医学化验，19世纪中期人们对尿液中的有形成分如白细胞、管型、病原性细菌等已经分析清楚，从而为泌尿系统疾病的诊断提供了可靠依据。其中细菌检测用于诊断泌尿系感染性疾病，其检查方法主要是利用显微镜进行检查、细菌培养确定细菌感染和观察对于细菌治疗敏感的抗菌药物。近些年，流式细胞技术逐渐发展成熟，结合新研制的细胞核酸结合染料，已经有报道利用流式细胞技术分离细菌，而测定尿液中细菌数量。 

所述这些方法存在的缺点： 

（1）利用显微镜检测细菌只能够检测细菌形态，不能够检测细菌类型和数量，其中最重要的缺点是检出率低，标本中细菌需要达到10⁹个/ml以上，才能够检出标本中的细菌，造成细菌假阴性的现象。 

（2）通过细菌培养检测尿液细菌的方法较敏感，并且能够同时检查细菌类型和确定细菌对抗菌药物的敏感性。另外，每次培养选择一种菌落只能够测定一种类型细菌，最大缺点检测需用时间约3天时间，对于感染性疾病重要的是及时诊断和早期用药治疗控制感染，因此难以适应诊断感染性疾病的要求。