[发明专利]一种带有绿色荧光蛋白基因的CA16感染性克隆及构建方法和应用

权利要求书

1.一种带有绿色荧光蛋白基因的CA16感染性克隆pACYC177-eGFP-CA16-FL，其序列为SEQ ID NO.1所示。

2.权利要求1所述感染性克隆的构建方法，步骤如下：

1）.提取亲本CA16（CA16/GD09/24）病毒株基因组RNA；

2）.CA16/GD09/24 病毒株基因组序列分段扩增：

以步骤1中的亲本CA16病毒RNA为模版，采用RT-PCR分别获得片段A、B、C和D，四对引物分别为SEQ ID NO.6和 SEQ ID NO.7；SEQ ID NO.8和 SEQ ID NO.9；SEQ ID NO.10和 SEQ ID NO.11；SEQ ID NO.12和 SEQ ID NO.13所示；四个片段分别用AatII和SmaI/ClaI插入低拷贝质粒pACYC177载体，质粒均经过DNA测序鉴定为正确序列，分别命名为CA16-A, CA16-B, CA16-C和 CA16-D；

3）.含有病毒基因组的CA16 cDNA全长感染性克隆的构建：

（1）CA16基因组片段A+B的拼接：用NdeI和SmaI酶切上述步骤2中所得的CA16-A和CA16-B，回收CA16-A的大片段与CA16-B的大片段；将CA16-A的大片段作为载体，CA16-B的大片段作为片段，使用T4 DNA连接酶将载体与片段连接，测序正确的质粒命名为CA16-AB；

（2）CA16基因组片段C+D的拼接：用AatII和SphI酶切上述步骤2中所得的CA16-C和CA16-D，回收CA16-C的大片段与CA16-D的大片段；将CA16-D的大片段作为载体，CA16-C的大片段作为片段，使用T4 DNA连接酶将载体与片段连接，测序正确的质粒命名为CA16-CD；

（3）CA16基因组全长A+B+C+D的拼接：用AatII和EcoRV酶切上述步骤中所得的CA16-AB和CA16-CD，回收CA16-AB的大片段与CA16-CD的大片段；CA16-CD的大片段作为载体，CA16-AB的大片段作为片段，使用T4 DNA连接酶将载体与片段连接，测序正确的质粒即为拼接完成的含有CA16全长基因组的cDNA质粒，命名为pACYC-CA16-FL；

4）.带有绿色荧光蛋白基因的CA16感染性克隆的的构建：

（1）插入BsiWI和NotI酶切位点，以及2A蛋白酶切割位点(AITTL)的CA16全长感染性克隆的构建：

     ① 片段T7-5’UTR-BsiWI-NotI-2A protease cleavage site-VP4的扩增：以pACYC-CA16-FL为模板，扩增含有T7-5’UTR-BsiWI-NotI的序列，引物为SEQ ID NO.6和SEQ ID NO.14所示；扩增含有NotI-2A protease cleavage site-VP4的序列，引物为SEQ ID NO.15和SEQ ID NO.13所示，2A蛋白酶切割位点(AITTL)的序列如SEQ ID NO.4所示，分别回收PCR产物；以上述所得的2段PCR回收产物为模板，扩增含有T7-5’UTR-BsiWI-NotI-2A protease cleavage site-VP4的序列，引物为SEQ ID NO.6和SEQ ID NO.13，回收DNA片段；

② pACYC177-CA16-FL-5’UTR-BsiWI-NotI-VP4克隆的构建：分别用AatII和SalI双酶切片段T7-5’UTR-BsiWI-NotI-2A protease cleavage site-VP4和质粒pACYC-CA16-FL，经过T4 DNA连接酶将回收的酶切产物进行连接，测序正确的质粒即为插入BsiWI和NotI酶切位点，以及2A蛋白酶切割位点(AITTL)的CA16全长感染性克隆，命名为pACYC177-CA16-FL-5’UTR-BsiWI-NotI-VP4；

（2）PCR扩增绿色荧光蛋白基因eGFP片段：

以带有eGFP基因的质粒pEGFPN1为模版，使用PrimeSTAR HS酶，扩增eGFP基因片段，序列为SEQ ID NO.5所示，扩增eGFP的引物为SEQ ID NO.16和SEQ ID NO.17；

（3）将绿色荧光蛋白基因eGFP插入载体pACYC177-CA16-FL-5’UTR-BsiWI-NotI-VP4：将eGFP和载体pACYC177-CA16-FL-5’UTR-BsiWI-NotI-VP4分别用BsiWI和NotI双酶切；经过T4 DNA连接酶将回收的酶切产物进行连接，测序正确的质粒即为带有绿色荧光蛋白基因eGFP的CA16感染性克隆。