[发明专利]一种H3N8亚型马流感重组病毒样颗粒疫苗及其制备方法和应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种马流感疫苗及其制备方法和应用，特别涉及一种H3N8亚型马流感重组病毒样颗粒疫苗及其制备方法和应用，本发明属于生物工程技术领域。

背景技术

马流感（Equine influenza，EI）是由正黏病毒科、流感病毒属A型流感病毒中的马流感病毒（Equine influenza virus，EIV）引起的马属动物一种严重的上呼吸道急性高度接触性传染疾病，多呈暴发性流行，传播迅速而且广泛，给养马业及赛马业造成严重的经济损失。OIE规定马流感为法定报告动物疫病，我国将其列为三类传染病。

近几年来EI在全世界频繁暴发，我国也不例外，在2007-2008年间我国多个省市均暴发了EI疫情，时值临近奥运会的举办，我国从国外进口EI疫苗进行紧急接种。EIV不仅可以感染马和驴等马属动物，甚至可以感染犬，EIV的跨种传播，因此也给公共卫生带来极大的安全隐患。目前，EIV在各种压力下正加速变异，危害严重。2012年8月在我国贵州省又暴发了EI疫情，对赛事造成了很大的影响。因此对EI进行监测和防控是本病的重点工作。而我国目前还没有具有自主知识产权的并针对我国EI流行株的用于防控EI的有效疫苗。而疫苗接种被认为是防控EI的有效策略，EI疫苗的广泛应用使EI疫情在全球得到了有效地控制，而我国绝大多数马匹未接种过EI疫苗，因此极易受到EIV的危害。

疫苗免疫在一定情况下也不能避免EI的暴发，这是由于EIV呈多元化进化，导致HA蛋白抗原性不同的多个谱系病毒株的出现，当疫苗株与流行株属于不同谱系时就不能产生完全的免疫保护。

对我国EIV的分子流行病学调查研究表明：我国EIV和国外进口疫苗株在进化上分属于Florida分支2和Kentucky分支两个不同的谱系，这给我们提出一个警示：进口疫苗能否对我国EI疫情提供有效防控？尚有待于实践检验。而研制符合我国国情的EI疫苗则是解决问题的根本。本研究将我国EI代表流行株的HA和M1基因重组到杆状病毒载体中，在昆虫细胞中进行HA和M1蛋白的表达，并对蛋白生物学特性进行了检测，为EI亚单位疫苗的研制提供了技术储备。

发明内容

本发明的目的之一是提供一种能够用于预防和治疗由H3N8亚型马流感病毒引起的EI的重组病毒样颗粒疫苗；

本发明的目的之二是提供一种制备所述重组病毒样颗粒疫苗的方法；

本发明的目的之三是提供所述的重组病毒样颗粒疫苗在制备防治H3N8亚型马流感药物中的应用。

为了达到上述目的，本发明所采用的技术手段为：

本发明的一种用于预防和治疗由H3N8亚型马流感病毒引起的EI的重组病毒样颗粒疫苗，含有由SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所述核苷酸序列用昆虫/杆状病毒表达系统表达后所得的H3N8亚型马流感重组病毒样颗粒蛋白和药物学上可接受的载体、佐剂或赋形剂。所述的H3N8亚型马流感重组病毒样颗粒蛋白，是将EIVA/Equine/xinjiang/3/2007(H3N8)（简写为XJ3）（该毒株已记载在文献：H3N8亚型EIV HA基因在昆虫细胞中的表达及生物学特性分析，刘春国等，《中国预防兽医学报》2013年11期中，现由中国农业科学院哈尔滨兽医研究所保存，提供。）的囊膜糖蛋白HA和基质蛋白M1基因共插入到杆状病毒双表达载体中，构建的重组杆状病毒表达的HA和M1在细胞中组装成病毒样颗粒，作为保护性抗原。插入的EIV囊膜糖蛋白HA基因具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列，插入的EIV基质蛋白M1基因具有SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列，以及与SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列具有95%以上同源性的核苷酸序列，或者编码相同蛋白质的与其具有遗传密码简并性的序列，或者它们的片段。

具体的，本发明所述的一种H3N8亚型马流感重组病毒样颗粒，其特征在于通过以下方法制备得到：将SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列或与SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列具有95%以上同源性的核苷酸序列，或者编码相同蛋白质的与其具有遗传密码简并性的核苷酸序列克隆到杆状病毒转移载体中，所得的重组杆状病毒转移载体转化DH10Bac感受态细胞，得到重组杆粒，重组杆粒转染Sf9昆虫细胞，并使其表达H3N8亚型马流感重组病毒样颗粒蛋白，纯化，即得。

在本发明中，优选的，所述的杆状病毒转移载体为杆状病毒双表达载体，更优选的，所述的杆状病毒转移载体为pFastBac Dual。