[发明专利]一种代谢工程改造大肠杆菌产圣草酚的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种代谢工程改造大肠杆菌产圣草酚的方法，属于代谢工程领域。

背景技术

近年来黄酮类化合物的抗氧化、抗炎、抗癌等对人类的保健和药用价值越来越得到科研人员的关注。以圣草酚为例，圣草酚具有抗菌抗炎的作用，在糖尿病的发病机制中起着至关重要的作用，可以抑制IgE/Ag诱导I型过敏反应，还具有止痛及温热作用。

尽管黄酮类物质对健康有众多益处，但该类物质的来源是其运用于保健医疗的的一个重大障碍。化学合成法多伴有有毒副产物和需要极端反应条件等不利因素，因而不利于大规模生产黄酮类物质。运用代谢工程技术改造大肠杆菌发酵生产圣草酚有望成为很好的解决方案。

采用代谢工程技术改造大肠杆菌，以酪氨酸为底物合成圣草酚在国内国外均未见报道。这主要是大肠杆菌内缺少P450单氧加酶家族的辅因子-P450还原酶以及P450细胞色素单氧加酶很难有效的可溶性表达。之前的研究，均以价格昂贵且微生物不能自身合成的咖啡豆酸(Caffeic acid)为底物合成圣草酚。Leonard等开发了从咖啡豆酸为底物的一条圣草酚代谢途径，他们在大肠杆菌中过量表达来自欧芹(Petroselinum crispum)的4CL，矮牵牛(Petunia X hybrid)的CHS和紫苜蓿(Medicago sativa)的CHI，以咖啡豆酸为底物成功获得了圣草酚产物。之后，研究人员在此途径基础上强化了丙二酰辅酶A代谢途径，使最终圣草酚产量达到了114mg/L。

本发明，在L-酪氨酸合成柚皮素这一重要的黄酮骨干途径的基础上融合表达截去N端膜结合域的非洲菊(Gerbera hybrid)黄酮3’羟化酶（tF3’H）和长春花(Catharanthus roseus)的P450还原酶（tCPR），成功实现了属于P450单氧加酶家族的F3’H在大肠杆菌中的可溶性表达，使大肠杆菌能利用价格便宜且自身能够合成的酪氨酸为底物合成圣草酚。

发明内容

本发明要解决的第一个技术问题是提供一种以酪氨酸为底物直接合成圣草酚的大肠杆菌基因工程菌，通过基因工程和代谢工程技术，在大肠杆菌内构建了由酪氨酸合成柚皮素的途径，并融合表达了截去膜结合序列的黄酮3’羟化酶基因tF3’H和P450还原酶基因tCPR以实现由柚皮素向圣草酚转化的途径。

所述大肠杆菌基因工程菌是以敲除了基因组乙酸激酶ackA基因的大肠杆菌为宿主，过表达了乙酰辅酶A合成酶基因和乙酰辅酶A羧化酶基因，从而阻断乙酰辅酶A的醋酸盐副产物途径，增加转化丙二酰辅酶A的通量以强化丙二酰辅酶A途径。

所述乙酰辅酶A合成酶基因acs来自E.coli BL21(DE3)基因组，乙酰辅酶A羧化酶基因acc（包括accBC和dtsR1两个基因）来自谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum ATCC13032)。所述乙酰辅酶A合成酶基因acs、乙酰辅酶A羧化酶accBC和乙酰辅酶A羧化酶dtsR1的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示，它们通过克隆到载体pRSFDuet-1（购自德国诺维信公司），得到重组表达载体pRSF-acs-ACC，然后转化大肠杆菌进行表达。

所述大肠杆菌基因工程菌表达了融合基因tF3’H-tCPR，以实现柚皮素向圣草酚的转化。所述融合基因tF3’H-tCPR的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，是截去膜结合序列的源于非洲菊(Gerbera hybrid)的黄酮3’羟化酶基因tF3’H和长春花(Catharanthus roseus)的P450还原酶基因tCPR这两个基因的融合基因。所述tF3’H-tCPR基因通过克隆于pACYCDuet-1（购自德国诺维信公司），得到重组质粒pACYC-tF3’H-tCPR，然后转化大肠杆菌进行表达。