[发明专利]一种调控干细胞分化及促进体内骨生成的钛合金表面改性方法

说明书

技术领域

本发明属于医用材料领域，涉及一种功能性材料界面的构建方法。

背景技术

细胞微环境是由溶性信号（如生长因子等）和非溶性信号（激素）等多种蛋白和糖蛋白组成的复杂的网络体系。在材料表面构建所需的细胞外微环境是新一代生物材料的研究的重要方向。近年来，研究人员都期望通过在生物材料表面构建细胞外微环境调控细胞的生物学响应。目前，通过不同技术手段，多种活性分子包括天然衍生细胞外基质（ECM）蛋白、脂质体、细胞垫、细胞粘附分子等被固定到生物材料表面以期模拟细胞外微环境。

理想的骨植入体应具备两个特点：第一，材料表面能募集成骨细胞或骨祖细胞并促进细胞粘附；第二，材料表面能提供适宜的生物活性分子（生长因子或细胞因子）促进细胞增殖及诱导细胞分化进而促进新骨生成。目前，骨植入体材料制备领域，尚有较大的研究的空间。

发明内容

本发明的目的是构建一种调控干细胞分化及促进体内骨生成的钛合金界面细胞微环境。

为实现本发明目的而采用的技术方案是这样的，一种调控干细胞分化及促进体内骨生成的钛合金表面改性方法，包括以下步骤：

1）通过多巴胺偶联将带负电荷的明胶固定在钛合金材料TC4的表面，获得经明胶修饰的TC4；

2）在步骤1）所获得的经明胶修饰的TC4表面构建壳聚糖、明胶和骨形态发生蛋白BMP2依次重叠的多层膜，得到经过多层膜修饰的TC4；

3）采用物理吸附的方式，在步骤2）所获得的经多层膜修饰的TC4表面沉积一层纤粘蛋白分子。

进一步，步骤1）的具体过程是：先将多巴胺溶于Tris缓冲溶液中，配置成浓度为2mg/mL的多巴胺溶液；再将钛合金材料TC4沉浸于所述多巴胺溶液中；最后取出经过多巴胺浸泡的钛合金材料TC4，将其用二蒸水润洗后，浸泡在明胶溶液中，获得经明胶修饰的TC4。

进一步，步骤2）的具体过程是：

a）配置浓度为1～10mg/mL的壳聚糖溶液、浓度为1～10mg/mL的明胶溶液和浓度为0.5～5μg/mL的BMP2溶液；

b）用二蒸水润洗步骤1）得到的经明胶修饰的TC4；按时间先后顺序执行c～f步骤；

c）将TC4置于壳聚糖溶液中，浸泡5～15min后取出，用二蒸水润洗；

d）将TC4置于明胶溶液中，浸泡5～15min后取出，用二蒸水润洗；

e）将TC4置于BMP2溶液中，浸泡5～15min后取出，用二蒸水润洗；

f）将TC4置于明胶溶液中，浸泡5～15min后取出，用二蒸水润洗；

g）重复步骤c～f若干次，在明胶修饰的TC4表面构建壳聚糖－明胶－BMP2－……多层膜。

进一步，步骤3）的具体过程是：配置浓度为0.5～5μg/mL的纤粘蛋白溶液，将步骤2）所获得的经多层膜修饰的TC4浸泡在纤粘蛋白溶液中0.5～2h后取出，用二蒸水润洗2次，即将纤粘蛋白沉积到经多层膜修饰的TC4表面。

值得说明的是，本发明的目的是提高钛及钛合金植入体与天然骨组织之间的骨整合性，在植入体表面构建预期的微环境来模拟天然细胞外基质能够促进植入体的骨整合。在先前的研究中，我们运用层层自组装技术将壳聚糖及明胶被组装到钛材表面。研究证实钛材表面的壳聚糖/明胶多层膜能够提高钛膜的生物相容性。然而，这种简单的细胞外基质对自然组织的被动性响应，在诱导骨生成应用方面有一定的局限性。理想的骨植入体应具备两个特点：第一材料表面能募集成骨细胞或骨祖细胞并促进细胞粘附；第二材料表面能提供适宜的生物活性分子（生长因子或细胞因子）促进细胞增殖及诱导细胞分化进而促进新骨生成。

基于上述研究，我们在Ti6Al4V表面构建类ECM样微环境，将骨形态发生蛋白(BMP2)及纤粘蛋白（FN）组装到壳聚糖/明胶多层膜修饰的Ti6Al4V表面。一方面，BMP2是一种维持骨动态平衡的生长因子，不但能促进间充质干细胞的增殖、迁移及分而且能诱导体内骨生成。另一方面，纤粘蛋白（主要的ECM蛋白质）能介导细胞在生物材料表面的初始粘附。当植入体植入体内后，细胞与材料接触时，我们期望通过FN及BMP2调控髓腔中骨髓间充质干细胞的粘附及分化级联响应行为。另外，生物活性因子（如BMP2）暴露于外界环境中时，易于变性或降解失去活性。研究证实，LbL多层膜在温和的环境中能维持药物/蛋白的生物活性。多层膜可以避免BMP2等活性因子直接暴露于外界环境中。