[发明专利]一种抗冻保护剂的制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别是涉及一种抗冻保护剂的制备方法。

背景技术

在低温冷链的众多食品加工和运输过程中、在医学器官移植等各个领域中，由于环境温度的波动变化而反复地遭受冰晶生长和重结晶的问题越来越受到人们的关注。温度的反复升降使冰晶不断生长、冻融和重结晶，严重破坏细胞和组织结构而失去产品应有的品质。如何控制冰晶生长及重结晶，实现低温冷链上的冰晶生长控制，是制约众多食品和医药产品品质的关键所在。

抗冻蛋白（anti-freezing proteins,AFP）是一类具有特殊功能的蛋白质，其存在于各种生命体中。它通过与冰晶结合来降低冰晶生长的温度和改变冰晶形成的大小和形态，从而起到重结晶抑制效应；而且它能以非依数性形式降低水溶液的冰点而对其熔点影响甚微，于是导致水溶液的熔点(melting point,MP)和冰点(freezing point,FP)之间出现一定的热滞活性(thermal hysteresis activity,THA)而产生热滞效应，从而帮助各种生物体抵御寒冷的环境。

最近的研究结果表明：抗冻蛋白的抗冻活性片断只存在于局部的特异性多肽链结构域，并不是整体蛋白质在起作用，即使经过纯化的抗冻蛋白的热滞活性也不高。因此，获得安全的、结构紧凑的高活性抗冻多肽就成为新兴的的研究方向。

目前，植物性抗冻蛋白的提取主要集中在高山高寒地区的高山雪莲、黑麦草、内蒙古沙冬青等植物性原材料，但这些原材料不易得到，成本高，并且其提取方法以“冰手指法”为主，不适合大规模的生产。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术中存在的技术缺陷，而提供一种材料易得，生产成本低的抗冻保护剂的制备方法。

为实现本发明的目的所采用的技术方案是：

一种抗冻保护剂的制备方法，在谷朊粉水溶液中加入碱性蛋白酶进行酶解，酶解液经分离、透析除盐、冷冻干燥得到抗冻保护剂；酶解条件为：碱性蛋白酶的浓度为2-6%，底物浓度为8%-12%、溶液pH值为7-9，酶解温度为45℃-65℃，酶解时间为0.5h-2h。

所述分离为在4-10℃条件下6000-10000r/min离心。

所述透析除盐采用3.5KDa的透析袋，在4-10℃的条件下透析24h。

所述冷冻干燥为在-72～-80℃的条件下干燥24-36h。

所得抗冻保护剂中含有的多肽分子量分布在8.04-50.12KDa。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

1、本发明的抗冻保护剂的制备方法采用碱性蛋白酶酶解谷朊粉中含有的大量的蛋白，通过对碱性蛋白酶切割条件的确定，制备出具有抗冻活性的多肽混合物，可作为在低温环境下减少细胞损伤的保护剂，制备方法简单，原料来源广泛，原料成本低，有利于降低抗冻保护剂的成本。而且，抗冻活性更加突出，热滞活性能够达到0.2℃左右。

2、本发明的制备方法在制备过程中，不添加任何有毒有害物质，同时，谷朊粉本身就是一种可食用性的植物性原材料，所得抗冻保护剂为天然产品，因此可以以添加剂的形式大规模的应用于食品行业。

3、本发明的制备方法通过酶解分离、透析除盐、冷冻干燥等方法从谷朊粉中得到多肽的混合物，即抗冻保护剂，操作过程简单，易于实现大规模生产。而且，显著的提高了谷朊粉的利用价值，为小麦谷朊粉的深加工提供了新的途径。

附图说明

图1为本发明实施例1中抗冻保护剂Tricine SDS-PAGE的电泳图谱；

图2为本发明实施例1中抗冻保护剂的熔点扫描图谱；

图3为本发明实施例1中抗冻保护剂当保留温度为-0.70℃时的冰点扫描图谱；

图4为本发明实施例1中抗冻保护剂冰晶生长及抑制冰晶生长效果图，其中A表示50mg/ml牛血清蛋白的冰晶生长图,B表示抗冻保护剂的冰晶生长图；

图5为本发明实施例2中抗冻保护剂的熔点扫描图谱；

图6为本发明实施例2中抗冻保护剂当保留温度为-0.50℃时的冰点扫描图谱；

图7为本发明实施例2中抗冻保护剂冰晶生长及抑制冰晶生长效果图，其中A表示50mg/ml牛血清蛋白的冰晶生长图，B表示抗冻保护剂的冰晶生长图；

图8为本发明实施例3中抗冻保护剂的熔点扫描图谱；

图9为本发明实施例3中抗冻保护剂当保留温度为-0.20℃时的冰点扫描图谱；

图10为本发明实施例3中抗冻保护剂冰晶生长及抑制冰晶生长效果图，其中A表示50mg/ml牛血清蛋白的冰晶生长图，B表示抗冻保护剂的冰晶生长图。