[发明专利]使用羧基修饰的金纳米颗粒的超灵敏闭管式比色环介导等温扩增法

说明书

本发明涉及使用羧基修饰的金纳米颗粒的超灵敏闭管式比色环介导等温扩增法。具体而言，本发明将MUA‑AuNP的由Mg²⁺和P₂O₇^4‑控制的颜色变化的新检测机制与LAMP结合，首次建立并结合了基于AuNP的比色和闭管式等温扩增的核酸检测平台，使可以用肉眼检测少至200个拷贝的靶DNA序列。由镁离子模板聚集控制颜色，并且在存在靶时，LAMP反应的副产物焦磷酸离子导致颗粒解聚。该平台具备高灵敏度、无残留污染、低成本等优点。

技术领域

本发明涉及特定核酸序列的简单检测方法。具体而言，本发明涉及将功能化的颗粒，如羧基修饰的金纳米颗粒，用于能够产生焦磷酸离子的核酸扩增体系中，如用于环介导的等温扩增方法中，以高灵敏度、低成本检测特定核酸序列的方法。

背景技术

用简单方式对特定核酸序列进行检测，可以赋予现场护理(point-of-care)诊断和现场病原体检测更大的价值。^[1]具有独特的比色性质的金纳米颗粒(AuNP)非常适合这项任务。^[2]AuNP在可见光区域表现出特有的表面等离子体共振(SPR)吸收带并且确切的频谱依赖于颗粒间的距离。具体地，颗粒凝集引起SPR吸收带红移并伴随红色到紫色的颜色变化。这一性质已用于特定核酸序列的液相比色检测。^[3-6]然而，先前所报道的检测平台并不具备实际应用所需要的所有基本属性，包括高灵敏度、简单温度控制、低成本以及无携带污染。这些平台绝大多数都使用寡核苷酸修饰的AuNP，^{[3a-d,4a,b,5a-g,6]}影响可见颜色变化的一个关键方面是靶序列的浓度必须在纳摩尔水平。^[3a-d]对于实际应用，需要更高的灵敏度。因此一直努力致力于将基于AuNP的比色检测与靶扩增相耦合。在扩增方面，涉及简单温度控制的等温技术^[5a-g]比热循环技术更可取。^[4a,b,6]另一个主要问题是，对于所有的等温^[5]辅助扩增平台和大多数热循环^[4](存在3个例外^[6])辅助扩增平台而言，扩增后不可避免地会开管添加AuNP探针(寡核苷酸修饰的和未修饰的两种)，这存在高风险的携带污染。AuNP探针与扩增反应的不相容性是由于热^[6b,7]和/或二硫苏糖醇诱导的^[8]寡核苷酸从AuNP上解吸，之后酶非特异性地吸附到AuNP表面上(或只是后者作用于未修饰的AuNP^[6b,9])。在3个闭管平台(全部是基于热循环和寡核苷酸修饰的AuNP)中，具有实用灵敏度的2个需要特别制备的寡核苷酸修饰的AuNP(二氧化硅包被的^[6b]或三硫醇化(trithiolated)的寡核苷酸^[6c])。另外，寡核苷酸修饰的AuNP的另一个问题是巯基修饰的寡核苷酸成本高。

环介导等温扩增法，英文名称为loop-mediated isothermal amplification，是一种新型的核酸扩增方法，其特点是针对靶基因的6个区域设计4种或者6种特定引物，在链置换DNA聚合酶的作用下，60-65℃恒温扩增，15-60分钟左右即可实现10^9-10^10倍的核酸扩增，具有操作简单、特异性强、产物易检测等特点。然而，环介导等温扩增方法也存在缺点，由于其灵敏度高，一旦开盖容易形成携带污染。

因此，本领域仍然需要低成本、高灵敏度、无携带污染的检测特定核酸序列的方法。

发明内容

本发明的第一方面涉及一种试剂盒，其包括：1）功能化的颗粒，其具有可用于能够产生焦磷酸离子的核酸扩增体系的比色和/或沉淀和/或荧光检测的性质，2）用于通过能够产生焦磷酸离子的核酸扩增体系检测样品中特定核酸序列存在的扩增引物，3）用于能够产生焦磷酸离子的核酸扩增体系的其他组分和装置。

在一些实施方式中，颗粒是具有任何依赖于粒子间距离来控制比色性质类的材料，如金纳米颗粒或银纳米颗粒；或者