[发明专利]重组草鱼干扰素-白介素1二联蛋白的制备方法及应用

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及基因重组方法及应用。

技术背景

草鱼肉质肥嫩，味道鲜美，同时具有食性简单、饵料来源广泛、生长迅速、经济效益明显等特点，为我国水产养殖一个优良的主养或配养鱼种，在渔业中占有重要地位。近几年来，我省草鱼的养殖规模以及养殖水平都有很大的提高，其养殖产量已跃居首位，为繁荣当地农村经济做出了很大贡献。然而，伴随着高密度养殖的发展，草鱼从鱼苗至成鱼的整个生长时期均备受各类疾病困扰，特别是病毒病和细菌病，这已成为制约草鱼良性发展的瓶颈。有关鱼病防控方法有很多，包括化学法、抗生素法和疫苗法等。化学法由于可能会对鱼体带来损伤并对水体环境的大规模污染甚至破坏而基本禁用；抗生素法只对细菌有良好的效果而无法杀灭病毒，并且会造成鱼体的抗生素法残留，使用便要非常慎重。疫苗法虽然效果较好但不稳定，也就大大限制了其推广应用。而在应对外界刺激、病原体侵袭的防御过程中，鱼类的非特异性免疫起着主要作用。除了巨噬细胞、细胞毒性细胞、粒细胞等具有吞噬功能的细胞外，目前已克隆获得了一系列与草鱼非特异性免疫相关因子的基因，主要包括干扰素、白介素、趋化因子、转铁蛋白以及抗菌肽等。因此，从长远来说，利用广谱的抗病基因进行鱼类疾病防治可能最有发展前途，这也符合当今绿色水产养殖要求。

干扰素(Interferon, IFN)是一类具有抗病毒、抗肿瘤、控制细胞凋亡、免疫调节等重要作用的细胞因子，由于其在机体非特异性免疫系统中扮演着重要角色而备受关注。IFN基因通常状态下并不表达，只有当受到病毒、dsRNA等诱生剂刺激后，通过一系列信号级联反应最终激活IFN基因的转录，或者通过与未感染病毒的细胞上IFN受体结合，诱导细胞产生大量的ISG(Interferon stimulated genes)蛋白来实现。类似于哺乳类细胞，在病毒或Poly I:C等诱导下，鱼类机体和细胞也会产生IFN。目前，已在斑马鱼(Danio rerio)等多种鱼类中获得了Type I IFN基因，其后鲫鱼(Carassius aruatus)Type I IFN基因的鉴定更充分证明了鱼类IFN系统的存在。本实验室通过基因组步移等方法也已克隆了草鱼(Ctenopharyngodon idella) I型干扰素完整基因组序列(GU139255)。白细胞介素(Interlecukin, IL)则是由活化的单核-巨噬细胞及淋巴细胞等产生的一类细胞因子，作用于淋巴细胞、巨噬细胞或其他细胞，负责信号传递，联络白细胞群，在机体免疫反应中发挥着重要的调节作用。白细胞介素家族庞大，迄今已在人和哺乳类中发现并命名的就有30余种。近年来，有关鱼类白细胞介素研究也获得重要进展，已克隆鉴定了IL-1、IL-2、IL-8、IL-10等家族成员。

随着基因重组技术的迅猛发展，重组蛋白药物的生产、应用日趋成熟。在哺乳类和鸟类中，重组IFNα/β已被广泛用于抑制肿瘤和治疗病毒性疾病。类似的，鱼类重组干扰素同样具有抗病毒活性。Altmann SM等发现(Molecular and functional analysis of an interferon gene from the zebrafish, Danio rerio. J Virol, 2003, 77(3):1992-2002.)，转染含IFN-α质粒的斑马鱼胚胎细胞ZF4，能明显增加对鳢弹状病毒(SHRV)感染的抵抗力。Li DM等研究表明(Immunoprotection of grass carp (Ctenopharyngodon idella) with recombinant interferon (rCiIFN) against GCHV infection. Aquaculture, 2013, 388–391:42-48.)，将0.1、1、10 μg/g鱼体重等三种不同剂量的重组草鱼干扰素(rCiIFN)经由腹腔注射免疫草鱼均能产生较好的免疫保护效力，但以1 μg/g鱼体重的免疫剂量为最佳；另外，以每天拌料投喂rCiIFN总量为1 μg/g鱼体重的剂量免疫草鱼1 d、2 d、5 d，发现连续投喂2 d的免疫组草鱼的相对存活率最高。荧光定量PCR的结果也佐证了这一结果，rCiIFN可以显著性地提高ISG的转录表达水平。

发明内容

本发明的目的是克服现有技术的不足，提出一种重组草鱼干扰素-白介素1二联蛋白的制备方法及应用。