[发明专利]动物源性制品中莱克多巴胺含量的快速测定方法

说明书

技术领域

 本发明属于食品安全检测技术领域，涉及一种测定动物源性制品中β肾上腺受体激动剂含量的方法，特别涉及一种动物源性制品中莱克多巴胺含量的快速测定方法。 

背景技术

莱克多巴胺是一种人工合成的β肾上腺受体激动剂，作为一种新型瘦肉精被一些养猪场使用。它可以加快畜禽生长速度，降低胴体脂肪含量，提高瘦肉率。人们食用了残留莱克多巴胺的动物组织后会出现中毒症状，对患高血压、青光眼、糖尿病、前列腺肥大等疾病的患者危害更大，严重的可能危及生命。对此药物在养殖业的使用范围和安全性世界各国的规定不尽相同。自2011年12月5日起在我国境内禁止生产、销售和使用莱克多巴胺。

因此，国家食品安全领域强制执行检测动物源性制品中莱克多巴胺的含量。现有测定动物源性制品中莱克多巴胺方法有液相色谱-质谱法、气相色谱-质谱法、高效液相色谱法、酶联免疫间接竞争法、胶体金法等。其中的酶联免疫间接竞争法：1971年瑞典学者Engvail和Perlmann,荷兰学者Van Weerman和Schuurs分别报道将免疫技术发展为检测体液中微量物质的固相免疫测定方法，即酶联免疫吸附测定法(Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay，ELISA)。ELISA现在已成为目前分析化学领域中的前沿课题，它是一种特殊的试剂分析方法，是在免疫酶技术(immunoenzymatic techniques)的基础上发展起来的一种新型的免疫测定技术。其中心就是让抗体与酶复合物结合，然后根据颜色反应的深浅来进行定性或定量分析。由于酶的催化频率很高，故可极大地放大反应效果，从而使测定方法达到很高的敏感度。但用酶联免疫间接竞争法测定动物源性制品中莱克多巴胺的含量时，存在样品处理时间较长、灵敏度低、检出限较高、检测成本较高的问题。 

发明内容

 本发明的目的是提供一种样品处理时间短、灵敏度更高、检出限更和检测成本低的动物源性制品中莱克多巴胺含量的测定方法，能快速测定动物源性制品中莱克多巴胺的含量。

为实现上述目的，本发明所采用的技术方案是：一种动物源性制品中莱克多巴胺含量的快速测定方法，具体按以下步骤进行：

步骤1：精确称取氯化钠4.0000g、十二水合磷酸氢二钠1.4500g、氯化钾0.1000g和磷酸二氢钾0.1000g，混合后用超纯水溶解并定容至500mL，得到磷酸盐缓冲液（PBS），该磷酸盐缓冲液的pH值为7.4，磷酸盐缓冲液过0.22μm微孔滤膜除菌，并保存在4℃下；

分别精确称取碳酸钠0.3975g和碳酸氢钠0.7425g，混合后用超纯水溶解并定容至500mL，得到碳酸盐缓冲液（CBS），该碳酸盐缓冲液的pH值为9.6，碳酸盐缓冲液过0.22μm微孔滤膜除菌，并保存在4℃下；

分别精确称取一水合柠檬酸2.5514g和十二水合磷酸氢二钠9.1951g，混合后用超纯水溶解并定容至500mL，得到底物缓冲液，该底物缓冲液的pH值为5.0，底物缓冲液过0.22μm微孔滤膜除菌，并保存在4℃下；

步骤2：精确称取牛血清白蛋白（BSA）1g，用步骤1中的磷酸盐缓冲液定容至100mL，得到BSA封闭液，BSA封闭液过0.22μm微孔滤膜除菌，并保存在4℃下；

取500mL步骤1中的磷酸盐缓冲液，加入250μL吐温-20，得到PBST洗液，PBST洗液过0.22μm微孔滤膜除菌，并保存在4℃下；

精确称取3,3',5,5'-四甲基联苯胺（TMB）0.0100g，溶于2mL二甲基亚砜中，得到TMB底物液，TMB底物液过0.22μm微孔滤膜除菌，并保存在4℃下；

量取20.00mL小牛血清、5.00g蔗糖、1.00g牛血清白蛋白和0.01g叠氮化钠，用步骤1中的磷酸盐缓冲液定容至100mL，得到抗体稀释液，并保存在4℃下；

称取5.00g蔗糖和1.00g牛血清白蛋白，用步骤1中的磷酸盐缓冲液定容至100mL，得到二抗稀释液，并保存在4℃下；

步骤3：分别取质量百分比浓度为10%的双氧水溶液21μL、步骤1配制的底物缓冲液10mL以及步骤2配制的TMB底物液200μL，混合，得到显色液；

称取98g浓硫酸，缓慢倒入200mL水中，此时该溶液会放热，待溶液恢复至常温定容至500mL，得到摩尔体积浓度2mol/L的硫酸终止液；

在盛放抗体的塑料容器中预先加满步骤2制得的抗体稀释液，放入37℃恒温箱中干燥孵育90min；甩干容器内液体，得到封闭好的抗体盛放容器，干燥保存在4℃冰箱；