[发明专利]一种β-淀粉酶的检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及检验测定技术领域，具体而言涉及β-淀粉酶的检测方法，更具体而言，本发明涉及β-淀粉酶分子量的检测方法和β-淀粉酶活力的检测方法。

背景技术

淀粉酶是一种水解酶，是目前发酵工业上应用最广泛的一类酶。淀粉酶一般作用于可溶性淀粉、直链淀粉、糖原等α-1，4-葡聚糖，水解α-1，4-糖苷键的酶，根据作用的方式可分为α-淀粉酶与β-淀粉酶。

α-淀粉酶广泛分布于动物(唾液、胰脏等)、植物(麦芽、山萮菜)及微生物。微生物的酶几乎都是分泌性的。此酶以Ca²⁺为必需因子并作为稳定因子，既作用于直链淀粉，亦作用于支链淀粉，无差别地切断α-1，4-链。因此，其特征是引起底物溶液粘度的急剧下降和碘反应的消失，最终产物在分解直链淀粉时以麦芽糖为主，另一方面在分解支链淀粉时，除麦芽糖外，还生成分支部分具有α-1，6-键的α-极限糊精。

β-淀粉酶与α-淀粉酶的不同点在于从非还原性末端逐次以麦芽糖为单位切断α-1，4-葡聚糖链。主要见于高等植物中(大麦、小麦、甘薯、大豆等)，但也有报告在细菌、牛乳、霉菌中存在。对于像直链淀粉，如可溶性淀粉那样没有分支的底物能完全分解得到麦芽糖。作用于支链淀粉或葡聚糖的时候，切断至α-1，6-键的前面反应就停止了，因此生成分子量比较大的极限糊精。

SDS-PAGE考马斯亮蓝染色法是常见的蛋白质分离方法。但是使用该方法来检测β-淀粉酶的分子量，还未见报道。

现在已有的检测β-淀粉酶活力的方法主要包括：黏度测定法、比浊法、糖化法、淀粉-碘比色法、酶速率法与染料释放法等。其中，黏度测定法和比浊法由于影响因素较多，缺乏特异性和灵敏度，己被淘汰。糖化法虽然可以直接测定酶活性，但是操作复杂。目前应用较为广泛的是碘量法、酶速率法和染料释放法。其中，淀粉-碘法因具有成本低、检测不需要昂贵仪器、试剂稳定、操作简便、结果可靠，所以应用范围最广。

淀粉-碘比色法测定β-淀粉酶的基本原理是：淀粉在β-淀粉酶的作用下生成部分糊精，淀粉与碘结合生成紫蓝色的络合物，而糊精与碘结合生成红棕色络合物，测定酶促反应分解一定量淀粉的时间，以红色糊精与碘反应的颜色作为终点指示(所给定的淀粉都已转化为糊精的时间)，用此方法的酶活力定义：60℃1小时内将1g淀粉转化为糊精的酶量为一个酶活力单位：

酶活力单位＝60/t*20*2％*N/0.5＝48N/t(U/m1)

t为反应达到终点所需要的时间；

N为酶的稀释倍数

但是淀粉-碘比色法测定β-淀粉酶活力存在以下缺点：红棕色滴定终点的观察因人而异，滴定终点不明显，存在误差较大，并且在碘滴定的过程中，由于碘液易升华挥发造成成分减少影响显色反应，致使检测结果准确性降低。

发明内容

本发明的目的在于提供一种检测β-淀粉酶分子量的方法。

本发明的另一目的在于提供一种稳定性高，准确性高的检测β-淀粉酶活力的方法。

为实现本发明的目的，本发明采用如下技术方案：

检测β-淀粉酶分子量的方法，包括：

步骤1、标准蛋白溶液的制备取分子量测定用标准蛋白(分子量范围30～66kD)适量，加蛋白上样缓冲液[取水4.8m1，浓缩胶缓冲液1.2ml，甘油1.0ml，10％十二烷基硫酸钠溶液2.0ml，0.5％(W/V)溴酚蓝溶液0.5ml，β-巯基乙醇0.5ml，混匀]制成每1μl中含10μg蛋白的溶液。临用前置水浴中5分钟，冷却。

步骤2、待测样品溶液的制备取待测样品适量(按蛋白含量计算)，加所述蛋白上样缓冲液制成每1μl中含10μg蛋白的溶液，临用前置水浴中5分钟，冷却。

步骤3、电泳分离照SDS-PAGE实验方法，采用垂直板电泳，各孔加10μl的所述待测样品溶液或所述标准蛋白溶液，电泳分离蛋白。

步骤4、染色步骤3结束后，将电泳胶放到染色液中(含0.2％(W/V)考马斯亮蓝G-250，45％(W/V)的乙醇或甲醇和10％(W/V)乙酸)，加热煮沸染色2分钟。

步骤5、脱色步骤4结束后，将电泳胶放入脱色液中(含7.5％乙酸和5％甲醇)，加热煮沸脱色10分钟。

步骤6、计算分子量以标准蛋白分子量的对数为纵座标，以迁移率为横座标，进行线性回归，由标准曲线上求得待测样品的分子量。

检测β-淀粉酶活力的方法，包括：

步骤1、在pH5.5的缓冲液中，待测样品与可溶性淀粉混合得到混合液，反应适当时间后使用1mol/L盐酸终止反应。