[发明专利]蝗虫Ⅰ型几丁质酶基因的序列及其dsRNA的应用

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域。具体涉及蝗虫Ⅰ型几丁质酶基因的序列及其dsRNA的应用。

背景技术

害虫是我国农业生产的大敌，长期施用化学杀虫剂，导致农药残留、环境污染严重、蝗虫出现抗药性、危害人类身体健康等等一系列问题。随着社会的发展，迫切需要新型的害虫防治方法。

近年来基于RNA干扰（RNAi）害虫防治技术正在高速发展。该方法有如下优势：1）选择对害虫专一的基因进行干扰，对高等动物和和人类是安全的；2）抗虫具有专一性，对非靶标生物无杀伤作用；3）对环境无毒无害。

针对蝗虫独特的蜕皮现象设计害虫防治方案，既可以高效杀灭害虫，又避免了环境污染，安全可靠。昆虫外骨骼主要由几丁质组成,昆虫几丁质酶基因负责几丁质的降解,以便昆虫蜕皮。蝗虫Ⅰ型几丁质酶基因（cht5）在蜕皮时起到关键作用，利用其重要生物学功能来进行害虫防治，省时省力，安全高效。

发明内容

本发明的目的是提供一种蝗虫Ⅰ型几丁质酶基因的序列及其dsRNA在致死害虫中的应用。

本发明提供的一种蝗虫Ⅰ型几丁质酶基因，其核苷酸序列是SEQ ID NO：1。该序列是通过对飞蝗转录组的搜索，得到1条飞蝗Ⅰ型几丁质酶基因片段，通过末端序列快速扩增（RACE）后，进一步克隆获得全长cDNA序列。该序列长1587bp，包含1515bp开放阅读框，编码505氨基酸。

本发明提供的一种蝗虫Ⅰ型几丁质酶基因片段，其核苷酸序列是SEQ ID NO：2，是根据SEQ ID NO：1设计上游引物SEQ ID NO：3和下游引物SEQ ID NO：4，通过PCR扩增获得SEQ ID NO：2，其含有T7启动子。进一步按照T7RiboMAX^TMExpress RNAi System（Promega）试剂盒说明体外转录合成dsRNA。

SEQ ID NO：2合成的dsRNA的在致死蝗虫中的应用：注射上述dsRNA到蝗虫体腔，结果表明：该dsRNA可以特异性地沉默蝗虫Ⅰ型几丁质酶基因LmCht5-1的mRNA表达，并导致飞蝗蜕皮困难而死亡。

附图说明

图1：5龄飞蝗注射SEQ ID NO：2合成的dsRNA后出现蜕皮困难而死亡的表型。左侧为注射dsGFP的对照，右侧为注射SEQ ID NO：2合成的dsRNA。

图2：飞蝗注射SEQ ID NO：2合成的dsRNA24小时后，飞蝗Ⅰ型几丁质酶基因LmCht5-1的mRNA沉默情况，β-actin做为内参基因。**P<0.01。

具体实施方式

实施例1：飞蝗Ⅰ型几丁质酶基因的序列及其dsRNA的获得

1、飞蝗Ⅰ型几丁质酶基因的序列获得

1）飞蝗Ⅰ型几丁质酶基因的序列在飞蝗转录组数据库的搜索

基于飞蝗转录组数据库，采用生物信息学方法对飞蝗Ⅰ型几丁质酶基因的序列进行搜索，经过序列分析及比对后，共获得1条飞蝗Ⅰ型几丁质酶基因的序列片段，该cDNA序列缺失3'末端。

2）飞蝗Ⅰ型几丁质酶基因的全长cDNA序列获得

基于已获得飞蝗Ⅰ型几丁质酶基因片段，采用primer premier5.0软件设计3’RACE引物。所有引物均由上海英潍捷基生物有限公司合成。提取飞蝗5龄若虫总RNA，用RACE试剂盒（clontech）合成RACE模板，用于全长cDNA序列调取。经PCR后，将得到产物纯化，克隆转化到大肠杆菌中，送去测序。结果分析后，拼接得到飞蝗Ⅰ型几丁质酶基因LmCht5-1cDNA全长序列，其序列为SEQ ID NO：1。

2、飞蝗Ⅰ型几丁质酶基因dsRNA合成

1）飞蝗Ⅰ型几丁质酶基因dsRNA引物的设计

基于所得到的飞蝗Ⅰ型几丁质酶基因序列SEQ ID NO：1，采用primer premier5.0软件设计。设计dsRNA合成引物，其序列分别为SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4。所有引物均由上海英潍捷基生物有限公司合成。

2）飞蝗Ⅰ型几丁质酶基因dsRNA的合成