[发明专利]一种损伤DNA-纳米金复合物及其制备方法与应用

说明书

技术领域

本发明属于蛋白质富集、分离和检测领域，具体地，涉及一种损伤DNA-纳米金复合物及其制备方法，该损伤DNA-纳米金复合物捕获药物损伤DNA应答蛋白的方法，以及该损伤DNA-纳米金复合物在药物损伤DNA应答蛋白的捕获和/或鉴定中的应用。

背景技术

以顺铂为代表的铂类抗肿瘤药物是细胞毒性抗肿瘤药物的典型代表。自1969年Rosenberg发现顺铂（Cisplatin）抑制细胞生长的生物活性以来，顺铂已成为临床上使用最为广泛的抗肿瘤药物，第二代铂类药物卡铂、奥沙利铂等也已相继进入临床使用。顺铂进入人体后，可扩散通过带电的细胞膜，进入细胞质内，被转运至细胞核，在染色质内和DNA形成一种链内交联复合物。高迁移率族蛋白1（HMGB1，high mobility group protein1）能特异性地结合顺铂与DNA形成的1,2-d(GpG)链内交联产物，阻止核酸切割酶对DNA的修复，抑制DNA的转录和复制，导致细胞凋亡或坏死。

迄今为止，人们对不同肿瘤细胞对金属抗肿瘤药物DNA损伤的分子应答机制及其差异还知之甚少。所以，从分子水平上研究DNA结合蛋白与损伤DNA-药物复合物的相互识别和相互作用，以及这种分子识别作用对细胞药物应答灵敏度的影响，对深入理解细胞毒性抗肿瘤药物的作用机理，进一步优化它们的分子设计具有非常重要的意义，也是药物发现领域所面临的最具挑战性的课题之一。

目前，捕获铂损伤DNA应答蛋白的方法包括：将含有光捕获基团的铂损伤DNA负载到磁珠表面或者将铂损伤DNA负载到糖球表面与大量的核蛋白溶液孵育以捕获应答蛋白。这些方法的主要不足是：由于磁珠或糖球等材料不溶于水，结合过程为非均相结合，所以需要使用大量的肿瘤细胞裂解液；而且没有设置对照，易将非特异性捕获的蛋白质作为应答蛋白；而且由于引入了光捕获试剂，铂损伤DNA的结构并不是生理条件下的结构，因此捕获的蛋白不一定是生理条件下的应答蛋白。

发明内容

本发明的目的是克服现有技术需要大量细胞裂解液且特异性较低的缺陷，提供一种使用少量细胞裂解液即可实现捕获且特异性高的损伤DNA-纳米金复合物及其制备方法、该损伤DNA-纳米金复合物捕获药物损伤DNA应答蛋白的方法以及该损伤DNA-纳米金复合物在药物损伤DNA应答蛋白的捕获和/或鉴定中的应用。

为了实现上述目的，第一方面，本发明提供了一种损伤DNA-纳米金复合物，该损伤DNA-纳米金复合物中，1摩尔的纳米金上结合有7-12摩尔的药物损伤的双链DNA。

第二方面，本发明提供了一种制备第一方面所述的损伤DNA-纳米金复合物的方法，该方法包括将药物损伤的双链DNA与纳米金接触，以使药物损伤的双链DNA与纳米金相连。

第三方面，本发明提供了由第二方面所述的方法制得的损伤DNA-纳米金复合物。

第四方面，本发明提供了一种捕获药物损伤DNA应答蛋白的方法，该方法包括以下步骤：

（1）将第一方面和/或第三方面所述的损伤DNA-纳米金复合物（也称为阳性探针）、没有被药物损伤的对照DNA-纳米金复合物（也称为对照探针）与细胞裂解液混合，以使损伤DNA-纳米金复合物与药物损伤DNA应答蛋白结合，所述对照DNA-纳米金复合物中，1摩尔的纳米金上结合有7-12摩尔的双链DNA，所述对照DNA-纳米金复合物中的双链DNA与所述损伤DNA-纳米金复合物中的药物损伤的双链DNA的碱基序列相同；

（2）除去未结合的蛋白，从而分离出捕获的蛋白；

（3）鉴定捕获的蛋白；

（4）应用基于稳定同位素标记的定量蛋白质组学方法对捕获的蛋白进行定量比较，排除非特异性的DNA结合蛋白，从而得到特异性识别药物损伤DNA的应答蛋白。

第五方面，本发明提供了第一方面和/或第三方面所述的损伤DNA-纳米金复合物在药物损伤DNA应答蛋白的捕获和/或鉴定中的应用。

通过上述技术方案，本发明的损伤DNA-纳米金复合物仅需要少量细胞裂解液即可实现药物损伤DNA应答蛋白的捕获，且蛋白捕获特异性高。此外，将本发明的损伤DNA-纳米金复合物用于捕获药物损伤DNA应答蛋白时，通过简单的离心步骤即可将捕获的药物损伤DNA应答蛋白与其他蛋白分离，简化了操作。

本发明的其他特征和优点将在随后的具体实施方式部分予以详细说明。

附图说明

附图是用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与下面的具体实施方式一起用于解释本发明，但并不构成对本发明的限制。在附图中：