[发明专利]一种单克隆抗体的生物学活性测定方法

说明书

技术领域

本发明涉及抗体的生物学活性测定技术领域，更具体地说涉及重组抗人表皮生长因子受体的单克隆抗体的生物学活性测定方法。

背景技术

表皮生长因子受体（Epithelial growth factor receptor，EGFR）是一种糖蛋白，属于酪氨酸激酶型受体，广泛分布于哺乳动物上皮细胞、成纤维细胞、胶质细胞、角质细胞等细胞表面，其信号通路在细胞的生长、增殖和分化等生理过程中发挥重要的作用（Hanley SC，Assouline-Thomas B，Makhlin J，et al.J Endocrinol，2011，211（3）：231-239）。研究表明，EGFR与肿瘤细胞的增殖、血管生成、肿瘤侵袭、转移及细胞凋亡的抑制有关，在许多实体肿瘤中存在EGFR的高表达或异常表达，因此可将EGFR作为肿瘤治疗的靶点（Kim H，Kim SH，Kim MJ，et al.J Immunother，2011，34（4）：372-381；Oh M，Lee JY，Shin DH，et al.Cancer Sci，2011，102（3）：597-604）。

单克隆抗体的生物学活性测定是重组生物制品质量控制的重要评价参数，关系到单克隆抗体的治疗效果。一般将体外细胞增殖抑制方法测得的生物学活性称为单抗的效价。

早在1963年，Slater就发现了线粒体中的脱氢酶(如琥珀酸脱氢酶、心肌黄酶)可将四甲基偶氮唑盐(MTT)的唑环打开，生成蓝色的产物甲(formazan)。根据这个原理，Mosmann（Mosmann T.J Immunol Methods,1983,65:55）于1983年创立了MTT检测法，此法在测定细胞的存活和增殖方面非常有效，因为这种颜色的变化仅仅发生在活的细胞中，并且甲的形成量与活细胞数和功能状态是成比例的。目前，MTT测定法已经广泛地应用于多种生长因子如表皮生长因子、肿瘤坏死因子、白细胞介素-2等的检测工作中。

目前通用的重组抗人EGFR抗体生物学活性的测定方法，是采用DiFi细胞或者MDA-MB-468细胞的增殖/WST比色法，均采用改进的MTT染色的方法。该法依据抗EFGR抗体对这些细胞的生长具有抑制作用，DiFi细胞或者MDA-MB-468细胞株的生长状况因重组抗EGFR抗体的生物学活性的不同而异，以此检测抗EGFR抗体的生物学活性。其测定法分别为：

（1）DiFi细胞增殖比色法：DiFi细胞株用完全培养液于37℃、5％二氧化碳培养，1640完全培养基重悬细胞，胎盘蓝染色，镜下计数，调整细胞浓度至2×10⁵个/ml，100μl/孔，振荡器混匀5分钟后，将96孔板置37℃、5%CO₂孵箱孵育90-102小时，孵育结束前将CellTiter96Aqueous Non-Radioactive Cell Proliferation Assay MTS试剂盒中的PMS和MTS融化并平衡至室温后，取100ul PMS加入2mlMTS中，混匀，加入细胞培养板，20ul/孔，37℃、5%CO₂孵育2小时。孵育结束后，加入10%SDS15ul/孔终止显色，490nm波长测定吸光度，结果使用Softmax5.0软件分析（张峰等，DiFi细胞增殖抑制法测定抗表皮生长因子受体单克隆抗体的生物学活性，第五次全国免疫诊断暨疫苗学术研讨会论文汇编[C],2011年）。

（2）MDA-MB-468细胞增殖/WST比色法：MDA-MB-468细胞用稀释液（含0.1g/L PF-68的F12/DMEM培养基）将细胞浓度调整至（5～8）×10⁴个／mL，加入96孔板，每孔100μL，空白对照加入100μL稀释液。用样品稀释液（含0.2%FBS的F12／DMEM培养基）将样品和参考品预稀释至50μg/mL，再3倍梯度稀释至0.023μg／mL，加入96孔板，每孔50μL，补加40μLF12/DMEM培养基（含5%FBS），37℃培养5天，加入30μL WST-8显色液，继续孵育4h，以630nm为参比波长，于波长450nm处测定吸光度（A）值。以蛋白浓度为横坐标，A450值为纵坐标，进行四参数拟合，得到反“S”型曲线，以半数有效浓度（EC₅₀）表示生物学活性。将50μg／mL的样品与参考品等体积混匀，按相同方式稀释并加样，测定回收率，按下式计算相对生物学活性和回收率（陶磊等，人源化抗表皮生长因子受体单克隆抗体质控方法的建立，中国生物制品学杂志，2013年01月第26卷第1期）。