[发明专利]周期型马来丝虫复合多价蛋白疫苗的制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种周期型马来丝虫复合多价蛋白疫苗的制备方法。

背景技术

丝虫病的流行不仅给人民的健康带来严重危害，也成为因病致贫的重要原因之一。目前治疗丝虫病的主要方法是采用化学药物，药物虽能降低感染率和发病率，但由于频繁应用，尚不能排除丝虫有潜在抗药性的危险，加上重复化疗和长期的监测措施需要昂贵的费用和大批专业技术人员。因此，为寻找控制丝虫病辅助或替代方法，丝虫疫苗的研究日益成为人们关注的问题。

尽管核酸疫苗在感染性疾病及肿瘤的防治中显示出巨大的潜能。但在实际应用中，由于DNA疫苗存在着一些亟待解决的问题而限制了它的广泛应用和进一步发展，主要是安全性问题限制了在人体上的应用，如质粒DNA整合到宿主基因组中会引起癌基因的活化或抑癌基因的失活；抗体在机体内的长期表达可能导致宿主的免疫耐受或自身免疫反应等；以及质粒DNA意外导入非靶细胞内会影响细胞的正常功能。其次，DNA疫苗因体内转染效率欠佳等原因，核酸疫苗所激发的免疫应答强度相对较弱，尤其在大动物以及人体内不足以引起足够的免疫保护效果。

蛋白疫苗是将编码某种外源性抗原的基因导入受体菌(如大肠杆菌)或细胞，使其在受体菌或细胞中高效表达，再以这种生物合成的基因表达产物制成的一类亚单位疫苗。蛋白质成功表达的关键是选择合适的表达系统。原核表达系统是最为成熟的外源蛋白表达系统，操作简单，可大量表达蛋白，但是缺乏真核生物的基因表达调控机制和蛋白质的加工修饰能力，表达产物不能自发折叠卷曲生成有一定空间结构和特定生物功能的蛋白质，常以包涵体形式存在，经过变性复性后，表达产物又容易失去免疫活性。而哺乳动物细胞表达系统具备完整的蛋白质组装和修饰系统，表达产物的构象多接近天然蛋白质。

发明内容

本发明的目的在于提供一种制备方便，效果好的周期型马来丝虫复合多价蛋白疫苗的制备方法。

本发明的技术解决方案是：

一种周期型马来丝虫复合多价蛋白疫苗的制备方法，其特征是：包括下列步骤：

（一）周期型马来丝虫pcDNA3.1（+）-BmCPI/BmGAPDH重组质粒的抽提：

(1)将含有重组质粒的菌种室温融化后取50ul加入到含有50ul、100mg/ml氨苄西林钠的100ml LB溶液中置于37℃恒温、250rpm的摇床培养12-16h，之后放置4℃冰箱冷却；

(2)菌液培养12-16h后，使用紫外分光光度计测定其OD600值，如果OD600数值在0.6-0.8之间，表明细菌处于旺盛生长的对数生长期，则可以用来进行质粒的抽提；

(3)取上述培养后的菌至50ml离心管内，5000rpm离心1分钟，收集沉淀，弃上清；

(4)每管加入5ml溶液I（悬浮液）,重悬细胞沉淀；

(5)之后每管加入5ml溶液II（裂解液），颠倒离心管4-6次，室温放置3-5分钟，使细菌完全裂解，溶液透明；

(6)每管加入5ml溶液III（结合液），随即颠倒离心管4-6次混匀，可见白色絮状物产生，然后5000rpm室温离心10-20分钟；

(7)将上清倒入或吸入到质粒纯化柱内，5000rpm室温离心2分钟，倒弃收集管内液体；

(8)在质粒纯化柱内加入7ml溶液IV（洗涤液），5000rpm室温离心2分钟，洗去杂质，倒弃收集管内液体，之后再5000rpm室温离心2分钟，除去残留液体并使痕量乙醇完全挥发；

(9)将质粒纯化柱置于50ml离心管上，加入2ml溶液V（洗脱液）至管内柱面上，放置2分钟，然后5000rpm室温离心2分钟，所得液体中加入10ml溶液VI（DNA纯化结合液）混匀后加到原质粒纯化柱内；

(10)再次室温离心2分钟后，倒弃收集管内液体；

(11)在质粒纯化柱内加入15ml溶液IV（洗涤液），5000rpm室温离心2分钟，近一步洗去杂质后，倒弃收集管内液体；

(12)5000rpm室温离心2分钟，除去残留液体并使痕量乙醇完全挥发；

(13)将质粒纯化柱置于50ml离心管上，加入2ml溶液V（洗脱液）至管内柱面上，放置2分钟；

(14)5000rpm室温离心2分钟，所得液体即为转细胞级超纯质粒；

(15)取DNA水溶液，用双蒸水稀释400倍，以双蒸水作空白对照，在紫外分光光度计上读取样品的测定浓度及A260/A280的值，并将其贮存于-20℃用于基因转染；