[发明专利]一种以香豆素为母核的半胱氨酸荧光探针及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种以香豆素为荧光母体的荧光探针，尤其涉及一种以2-(3-乙酰基)香豆素基丙烯酸酯为母体的半胱氨酸荧光探针及其应用；属于有机小分子荧光探针领域。

背景技术

香豆素具有较大的摩尔消光系数和量子产率，是很重要的绿色荧光染料，经过修饰后用于发光材料、化学传感器以及标记生物分子。近几年利用荧光增强效应检测活体细胞中半胱氨酸的研究得到不断发展。

半胱氨酸在细胞内的含量为30-200μM，是细胞中很重要的成分，是谷胱甘肽、辅酶A、氨基乙磺酸的前驱体，铁硫磺族的硫化物的来源等。同时也具有很多重要的生物化学作用，例如生物催化、转录修饰、解毒等。半胱氨酸缺乏时会引起很多并发症，儿童生长缓慢、皮肤衰老、头发褪色、肝损伤和水肿等。而半胱氨酸含量过高会引起风湿性关节炎、帕金森综合症，老年痴呆症，不良妊娠反应等。因此在生物和环境样品中生物分子硫醇的检测始终吸引着科学研究者的极大兴趣。但检索发现中国专利如【201110439870】、【201210586667】、【201210441256】中有报道可以选择生物体中的活性硫醇，而专一性选择半胱氨酸的专利却很少。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明要解决的问题是提供一种以香豆素为荧光团的高选择性和高灵敏度的半胱氨酸荧光探针及其应用。

本发明所述的以香豆素为荧光团的半胱氨酸荧光探针，其特征在于：所述荧光探针是2-(3-乙酰基)香豆素基丙烯酸酯，其化学结构式如式（I）所示：

上述2-(3-乙酰基)香豆素基丙烯酸酯由如下方法制得：

2,4-二羟基苯甲醛与乙酰乙酸乙酯反应得到3-乙酰基-7-羟基香豆素，然后与丙烯酰氯反应得到2-(3-乙酰基)香豆素基丙烯酸酯。

上述的荧光探针2-(3-乙酰基)香豆素基丙烯酸酯作为半胱氨酸荧光探针在检测PBS/乙醇缓冲液、牛血清或细胞中的半胱氨酸的应用。

本发明所述的2-(3-乙酰基)香豆素基丙烯酸酯可以与半胱氨酸发生迈克加成环化反应，释放出具有荧光的3-乙酰基-7-羟基香豆素，从而达到检测的效果，见图1。

配制2-(3-乙酰基)香豆素基丙烯酸酯的PBS/乙醇缓冲液（pH=7.4，v/v=2:3）的溶液，分别定量加入微升级的Cys,Hcy,GSH,arginine,aspartic acid,glutamic acid,glycine,histidine,lysine,proline,threonine,tryptophan,tyrosine,KNO₃,Ca(NO₃)₂,NaNO₃,Mg(NO₃)₂,Zn(NO₃)₂,Fe(NO₃)₃,H₂O₂和葡萄糖的水溶液。通过紫外可见分光光度法和荧光分光光度法测试对不同氨基酸、人体常见金属离子、双氧水和葡萄糖的选择性和响应能力，结果见图1-3。

在不加入NEM和加入NEM的活HeLa细胞中加入2-(3-乙酰基)香豆素基丙烯酸酯，对照细胞染色后荧光显微成像变化，结果见图4。

在不同浓度牛血清中加入1μM的2-(3-乙酰基)香豆素基丙烯酸酯检测其荧光强度变化，结果见图5。

本发明设计合成的2-(3-乙酰基)香豆素基丙烯酸酯可以与半胱氨酸发生加成环化反应，从而使溶液发出荧光，专一的选择半胱氨酸，能够区分半胱氨酸与还原型谷胱甘肽、同型半胱氨酸，实现了对半胱氨酸的微量高灵敏度检测，具有重要的应用价值。

附图说明

图1：为2-(3-乙酰基)香豆素基丙烯酸酯的PBS/乙醇缓冲液（pH=7.4，v/v=2:3，10μM）中加入不同的氨基酸、常见金属离子、双氧水、葡萄糖和半胱氨酸的紫外吸收图谱。

图2：为2-(3-乙酰基)香豆素基丙烯酸酯的PBS/乙醇缓冲液（pH=7.4，v/v=2:3，10μM）中加入不同的氨基酸、常见金属离子、双氧水、葡萄糖和半胱氨酸的荧光发射图谱。

图3：为2-(3-乙酰基)香豆素基丙烯酸酯与半胱氨酸加成环化产物的高分辨质谱。

图4：为2-(3-乙酰基)香豆素基丙烯酸酯在HeLa细胞内荧光显微成像图。