[发明专利]一种猪干扰素α1与胸腺肽α1融合蛋白的制备技术

说明书

技术领域

本发明涉及兽用生物制药领域，特别是涉及一种猪干扰素α1与胸腺肽α1融合蛋白的制备技术。

背景技术

干扰素（IFN）是细胞分泌的小肤，具有抗病毒，抗增生和免疫调节等广泛的生物学活性。与人干扰素（HuIFN）相似的猪干扰素（poIFN）也分为I型和Ⅱ型。猪干扰素α1（poIFNα1）属I型干扰素，具有广谱、高效抗病毒的功能，且具有毒副作用小、速效多能的特点，并对免疫系统起关键调节作用。种属特异性是干扰素的基本特性之一，但猪白细胞干扰素（PLeIFN，其主要成分为α干扰素）可在很多异种细胞上表现强的抗病毒活性。罗经等发现，它在人胚肺细胞和在仔猪肾原代细胞上有相同的抗病毒活性[罗经等,1980]。也曾有报道猪脾细胞干扰素（pSINF，主要成分为poIFN-α及poIFN-β）在人胚肺细胞及人胚肌皮细胞株上的抗病毒活性比在仔猪肾原代细胞上高17倍。胸腺肽（THY）是由胸腺的组织上皮细胞分泌的一类多肤激素，其主要活性成份是由28个氨基酸组成的胸腺肽α1（THYα1），在不同种属间高度保守[Franco F l,et al,1992]。主要作为免疫调节剂使用，还具有增强NK细胞功能，促进CD3+、CD4+、CD8+细胞增生，抗CD3+诱发的细胞凋亡，抑制肿瘤生长等一系列生物功能[Bela B,et al,2000]，研究显示其在改善临床症状和降低死亡率方面具有明显的治疗效果。细胞因子融合蛋白的应用有可能减少细胞因子单独使用时的毒副作用[郁子扬,2004]。近几年研究证实，干扰素和胸腺肽联合应用具有协同促进T细胞生长、增殖、分化和激活NK细胞活性等功能，可增强机体的免疫能力[曲建慧等,2006；王淑彩等,2002]。

我国是世界养猪第一大国，同时也是猪病多而复杂的国家。猪的疾病，尤其是病毒性疾病严重地危害着我国畜牧业的持续发展，部分人畜共患病毒病还直接危害人类的健康。针对这一日趋严重的问题，迫切需要生产一种针对于猪的疾病，具有生物活性高，广谱抗病毒的药物，目前临床上治疗病毒性疾病主要应用高免血清，治疗药物比较单一。IFNα1和THYα1均具有广谱抗病毒作用，二者融合蛋白生物制剂的研制一方面可以简化生产工艺，显著降低生产成本;另一方面IFNα1和THYα1融合蛋白的联合应用能显著提高IFN和THY抗病毒的功效。本研究通过DNA重组技术构建猪IFNα1与THYα1融合基因表达载体，建立原核表达系统，分离纯化目的蛋白，为IFNα1和THYα1融合蛋白制剂的工业化生产提供技术支撑。

发明内容

本发明的目的在于制备和分离纯化猪干扰素α1与胸腺肽α1融合蛋白。

为实现上述目的，本发明提供了一种猪干扰素α1与胸腺肽α1融合蛋白的制备技术，基本过程如下：根据GenBank已公布的猪干扰素α1（序列号DQ249000）基因序列及胸腺肽α1（序列号770552A）序列，合成扩增引物，融合扩增猪干扰素α1和胸腺肽α1的全基因序列，克隆并诱导表达谷胱甘肽巯基转移酶（GST）-干扰素α1-胸腺肽α1融合蛋白，检测鉴定，分离纯化融合蛋白。

进一步的，所述的猪干扰素α1和胸腺肽α1的全基因序列是通过过桥PCR融合扩增的，所述的过桥PCR是通过4条引物实现的，所述引物的序列分别为引物1：5’-CATATGTGCGATCTGCCGCAGACCC-3’；引物2：5’-CGAGCCGCCGCCGCCGCCGCGCGCCGAGCCGCCGCCGCCCAGATTACGGCTGCTGCTAAACGC-3’；引物3：5’-GGCGGCGGCGGCTCGGCGCGCGGCGGCGGCGGCGGCTCGTCGGATGCGGCGGTGGAT-3’；引物4：5’-CTCGAGTCATTAATTTTCCGCTTCTTCC-3’。

进一步的，所述的猪干扰素α1和胸腺肽α1的全基因序列与载体连接克隆表达，所述载体是pMD18-T和pGEX4T。

进一步的，所述的猪干扰素α1和胸腺肽α1的全基因序列在LB液体培养基中用IPTG诱导表达，所述IPTG的浓度为0.5~5 mmol/L，所述的LB液体培养基含Amp^r。

进一步的，所述的检测鉴定中使用的二抗是HRP-羊抗鼠IgG。

再进一步的，所述的融合蛋白分离纯化方法采用亲和柱层析法。

本发明的有益效果是：

（1）该融合蛋白制备技术的原料来源安全充足，生产成本低；制备过程简单，可操作性强，可进行大规模进行生产。