[发明专利]一种诱变菌种及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种诱变菌种及其应用，具体涉及吸水链霉菌井冈变种(Streptomyces hygroscopicus var.jinggangensis)CGMCC No.3130及其在发酵生产有效霉素中的应用。 

背景技术

根据文献报道，有效霉素包括多种组分，其中常量组分为有效霉素A(validamycin A，相对分子量为515)、有效霉素B(validamycin B，相对分子量为531)及其水解去一个葡萄糖产物有效霉素氧基A(validoxylamine A)，有效霉素A占约70％，具有高效、无毒、易于推广等特点，是亚洲水稻产区运用最为广泛的一种抗水稻真菌病害农用抗生素。 

在糖尿病治疗药物研究中发现，用于控制糖尿病患者餐后血糖的新型α-糖苷酶抑制剂(α-glucosidase inhibitor)，其基本母核具有胺基环醇(aminocyclitol)结构，该基团可以由有效霉烯胺经过结构改造得到，例如已上市的阿卡波糖(Acarbose)以及伏格列波糖(Voglibose)。而有效霉素的基本结构中含有效霉烯胺基团，因此目前有效霉素更有价值的应用是经化学降解或微生物转化生产α-糖苷酶抑制剂的关键中间体——有效霉烯胺 (valienamine)和有效霉胺(validamine)。 

关于有效霉素的发酵生产方法已有很多文献报道，如中国微生物菌种保藏中心管理委员会普通微生物中心(CGMCC)提供的方法、美国发明专利US4011391、中国发明专利CN101298623A等，一般包括菌种活化与平板培养、种子培养、发酵培养等步骤，产物为以有效霉素A为主的多组分混合物，具有产物纯度不高、分离纯化较难、化学污染多等缺陷。 

本发明是以一种诱变菌种——吸水链霉菌井冈变种发酵生产有效霉素。利用该菌种以公知的方法发酵生产有效霉素，其主要组分为有效霉素B，具有转化效率高、产物纯度高、分离纯化容易、化学污染少等优点。 

发明内容

本发明的目的是提供一种诱变菌种及其应用。 

本发明是以一种诱变菌种发酵生产有效霉素。该菌种的分类命名为：吸水链霉菌井冈变种，Streptomyces hygroscopicus var.jinggangensis；保藏单位名称为：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏地址为：北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所；保藏日期为：2009年06月19日；保藏编号为：CGMCC No.3130。利用该菌种以公知的方法发酵生产有效霉素，其主要组分为有效霉素B，具有转化效率高、产物纯度高、分离纯化容易、化学污染少等优点。 

具体实施方式

以下结合实施例进一步说明本发明。应该理解的是，本发明的实施例是用于说明本发明而不是对本发明的限制。在不违背本发明的精神和原则的前提下，对发明个别技术步骤进行的任何改动和改变都属于本发明要求保护的范围。 

实施例1：参照CGMCC提供的发酵方法 

1.实验材料 

采用的菌种：吸水链霉菌井冈变种(Streptomyces hygroscopicus var.jinggangensis)CGMCC No.3130。 

2.实验步骤 

(1)菌种活化与平板培养 

取冻存的甘油孢子悬液密集的在YMS平板均匀涂布。接种完毕后置于30℃培养5-6天可以得到青色或者灰色的孢子。往产孢丰满的平板加入3～4ml的无菌水，同时以棉签轻轻刮动平板表面覆盖的孢子，将其悬浮于无菌水中。 

(2)种子培养 

将不锈钢弹簧卷曲成环状，置于250ml三角瓶中，然后装入50ml种子培养基，灭菌。待培养基冷却后，吸取孢子悬浮液10L加入摇瓶中，进行接种。接种后，将摇瓶分别至于28℃，30℃，35℃温度下220转培养，20个小时。每个温度设置3个平行实验。 

(3)发酵培养 

发酵摇瓶为250ml，放入弹簧后装入发酵培养基50ml，灭菌。转接时，首先将三个平行的种子摇瓶混合在一起，而后用5ml移液管吸取5ml的种子转移到发酵摇瓶，培养自28℃，30℃，35℃的种子各接种9个摇瓶。置于相应的温度条件下，200转培养。在满36，48，60小时取3个摇瓶进行检测。 

(4)有效霉素成分检测 

发酵液离心除去菌体后，加入等体积的氯仿强烈震荡，随后12000g离心10分钟除去蛋白沉淀。上清液用0.2m滤膜过滤后用HPLC-MS进行分析。色谱条件5mM/L，pH＝7.0，磷酸盐缓冲液∶色谱纯甲醇＝98∶2(体积比)，流速1ml/min，检测波长210nm，Eclipse XDB-184.6mm×150mm分析柱，柱温25℃。MS采用ESI电离。有效霉素B的鉴定，MS(ESI)m/e：532(M+H)⁺，含量90％(面积归一化)。