[发明专利]使用肠杆菌科细菌生产L-氨基酸的方法

说明书

本申请是申请日为2011年01月17日，申请号为201110008628.2，发明名称为“使用肠杆菌科细菌生产L-氨基酸的方法”的发明专利申请的分案申请。

技术领域

本发明涉及微生物产业，特别涉及使用肠杆菌科的细菌生产L-氨基酸方法，所述细菌具有来源于属于泛菌属(Pantoea)的细菌的蛋白质，且所述蛋白质能够赋予对半胱氨酸的抗性。

背景技术

常规上，L-氨基酸是通过利用从天然来源获得的微生物菌株，或其突变体的发酵方法进行工业生产的。通常，对所述微生物进行修饰以提高L-氨基酸的产量。

已经报道了许多提高L-氨基酸产量的技术，包括用重组DNA转化微生物(美国专利号4,278,765)。其它提高产量的技术包括增加参与氨基酸生物合成的酶的活性和/或使所述目标酶对由所得的L-氨基酸导致的反馈抑制脱敏(desensitize)(美国专利号4,346,170、5,661,012和6,040,160)。

公开了一种新的微生物菌株，其适于发酵生产L-半胱氨酸、L-胱氨酸、N-乙酰基-丝氨酸(其是从O-乙酰基-L-丝氨酸通过非酶法转化生产的)，和/或噻唑烷(thiazolidine)衍生物。该新菌株过表达至少一种编码介导抗生素或其它对所述微生物有毒的物质的细胞清除的蛋白质的基因(EP0885982)。

已经在基因库(gene bank)中鉴定了一种来自大肠杆菌(Escherichia coli)的染色体片段，其能够在工业生产菌株中增加半胱氨酸的产量。亚克隆和遗传分析显示其原因是编码299个氨基酸的产物的开放阅读框，称为Orf299。在T7聚合酶/启动子系统中合成了该Orf299，其显示了膜内在蛋白质的特性。这些结果进一步表明ORF299编码负责排出半胱氨酸途径的不同代谢物的输出泵(export pump)(Dassler T.等，Mol.Microbiol.;36(5):1101-12(2000)。

发现ORF yfiK基因当在一种工业大肠杆菌生产菌株中过表达时，能够增加半胱氨酸的生产。yfiK基因产物为膜内在蛋白质，具有约六个预测的跨膜螺旋，且其属于输出蛋白(export protein)的RhtB家族。从质粒过度产生YfiK导致O-乙酰基-L-丝氨酸和半胱氨酸强烈(drastic)并平行(parallel)地分泌到培养基中，但仅当所述生物具有对由半胱氨酸导致的反馈抑制不敏感的丝氨酸转乙酰酶时方如此。当将过量的O-乙酰基-L-丝氨酸添加至培养基中时，在携带yfiK的转化体以及在野生型菌株中，这种对于半胱氨酸分泌过程中存在反馈非敏感性丝氨酸转乙酰酶的需要均被消除。ΔyfiK突变体并不显示任何表型，且当用携带ydeD(之前已表征的另一种O-乙酰基-L-丝氨酸/半胱氨酸输出蛋白)的质粒转化时，能够输出O-乙酰基-L-丝氨酸和半胱氨酸。因为ydeD-yfiK双重突变体显示相同的表现模式(pattern)，看来YfiK和YdeD独立地起作用。细胞需要藉由输出蛋白的合成来调节O-乙酰基-L-丝氨酸内部储备池(internal pool)大小可能与该化合物(当外源供应时)可抑制生长的事实有关。ydeD或yfiK的过表达可减轻该抑制，并增加对O-乙酰基-L-丝氨酸的类似物重氮丝氨酸(azaserine)的抗性(Franke I等,J Bacteriol.;185(4):1161-6(2003))。