[发明专利]优化的猪圆环病毒ORF2截短基因

说明书

技术领域

本发明属于属于生物技术领域，特别涉及优化的猪圆环病毒ORF2截短基因。

背景技术

猪圆环病毒(PCV)是一种小的、二十面体对称、无囊膜、共价闭合、单股环状DNA病毒，是引起断奶仔猪多系统衰竭综合征的主要病原。根据PCV的致病性及全基因组序列，可分为两个血清型：PCV1与PCV2。PCV2含有两个主要开放阅读框ORF1和ORF2。其中ORF2为702bp，编码233个氨基酸，是病毒的主要结构蛋白，具有良好的免疫原性，是构建重组疫苗的首选基因。

PVC2的ORF2基因编码Cap蛋白，为病毒的外壳蛋白。Cap蛋白是病毒的主要抗原。市场上已经有以Cap蛋白为主要成份的疫苗产品。目前用做疫苗的Cap蛋白主要由昆虫细胞表达系统生产。还未见微生物发酵生产的疫苗产品。

大肠杆菌是得到广泛应用的蛋白生产菌种。ORF2外壳蛋白在大肠杆菌中的表达已经有不少研究报道。比如，孙继国2009，查振林2005，周伦江2008，陈德坤2010，zhang Gaiping2012。但所有上述报道均未能表达ORF2的全长基因序列，而是去除信号肽NLS的截短序列。目前认为，其原因是ORF2外壳蛋白在N端的一段NLS序列，含有大肠的稀有密码子。

在研究人员的努力下，已有少数研究组成功的在大肠杆菌中成功的表达了ORF2基因。Celer2007报道，成功的在大肠杆菌的特殊菌种BL21-CODON-PLUS中表达了ORF2全长基因序列。其成功在于运用了特殊的菌种，这种菌种被插入了多个野生型大肠杆菌不具备的稀有密码子基因。另一个技术路径是通过改变原ORF2基因的密码子使用方法，得到优化的适于在大肠杆菌中表达的基因。Bumba2009首先报道了一个优化的序列(Genbank EU376523)，使得ORF2蛋白在大肠杆菌BL21中获得了10mg/L的表达量。Huang2012等人又报道了一个优化的序列(Genbank AY885225)，同样获得了全长蛋白的成功表达。这两个序列是目前已知的两个优化的ORF2-NLS序列。

枯草芽孢杆菌作为很有吸引力的外源基因表达的宿主，是目前原核表达系统中表达和分泌外源蛋白较理想的宿主。国内外在开发和使用枯草芽孢杆菌作为克隆和表达系统方面做了许多研究，但是到目前为止尚未有枯草芽孢杆菌表达PCV2-ORF2基因序列的的报道。

发明内容

为了解决现有技术中的不足，本发明的目的为提供能够在枯草芽孢杆菌中成功得到表达的优化的猪圆环病毒ORF2截短基因。

为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

优化的猪圆环病毒ORF2截短基因，所述基因的核苷酸序列为SEQ ID NO.1。

所述基因在枯草芽孢杆菌中表达。

所述枯草芽孢杆菌为BS168或WB800。

本发明采用以上技术方案，通过将去除NLS片段并根据密码子偏好性优化后的截短基因，能够成功的在枯草芽孢杆菌中得到表达。

附图说明

下面将结合附图说明和具体实施方式对本发明做进一步详细的说明。

图1为本发明优化的猪圆环病毒ORF2截短基因的表达载体质粒PHT43-ORF2双酶切后经琼脂糖凝胶电泳的图谱（1.PHT43-ORF2经双酶切的电泳条带；2.PHT43-ORF2未酶切的电泳条带；3.DL2000DNA Ladder Marker）；

图2为本发明优化的猪圆环病毒ORF2截短基因的表达质粒PHT43-ORF2成功转化枯草芽孢杆菌168后，提取表达菌株中质粒经BamH1和Sma1双酶切后经琼脂糖凝胶电泳的图谱（1.BS168/PHT43-ORF2经双酶切的电泳条带；2.BS168/PHT43-ORF2未酶切的电泳条带；3.DL2000DNA Ladder Marker）；

图3为本发明优化的猪圆环病毒ORF2截短基因的表达质粒PHT43-ORF2成功转化枯草芽孢杆菌WB800后，提取表达菌株中质粒经BamH1和Sma1双酶切后经琼脂糖凝胶电泳的图谱（1.WB800/PHT43-ORF2经双酶切的电泳条带；2.WB800/PHT43-ORF2未酶切的电泳条带；3.DL2000DNA Ladder Marker）；