[发明专利]一种新型T载体及其应用方法

说明书

技术领域

本发明属于生物工程领域，具体涉及分子生物技术、微生物工程、基因工程等技术领域中的一种新型T载体，更涉及一种高效转化、双向表达型T载体的结构、性质及应用技术。 

背景技术

将待克隆的DNA片段成功插入载体DNA，是筛选目标克隆进而测定基因序列、分析基因结构与功能、进行基因重组表达等研究工作的首要步骤。发展能够与DNA片段高效连接和高效转化的新型载体有利于简化基因操作步骤、节省材料和时间；提高基因克隆的准确性和成功率；加快研究进展、获得更多科技成果。 

DNA的末端状态和首尾匹配状况对插入片段与载体之间的连接率的影响很大。粘性末端连接要比平末端连接的效率高，人们通常选用限制性DNA内切酶对片段和载体进行切割，产生带粘性末端的插入片段和线性化载体以便连接。但是，由于这些DNA首尾粘性末端的序列互补，易发生插入片段的自相连接，以及线性载体自身的首尾连接，从而降低了连接效率。TA克隆技术采用另一种方式进行粘性末端连接：Taq DNA聚合酶扩增产生的PCR产物的双链两端各带有1个3’端悬挂的A(腺苷酸)，能够与末端带有T(胸腺核苷酸)的载体进行连接(Holto et al.，1991，Nucleic Acids Res，19：1156)。因为TA克隆中每一段线性DNA的两端序列不能相互配对，从而有效地避免了目标基因片段之间的相互连接或载体的自身环化。 

TA克隆技术已经广泛应用于PCR产物的克隆，其原理是TaqDNA聚合酶具有非模板依赖性末端转移酶活性，能够在双链DNA的3’末端加上1个核苷酸。用Taq DNA聚合酶扩增得到的PCR产物的末端通常被加上1个A；为了与之互补，人们用限制性内切酶如EcoR V切割载体质粒产生平末端，再用TaqDNA聚合酶在线性质粒两端添加T，所制成的两端带有3’端悬挂T的、用于TA克隆的载体被称为T载体。 

目前市场上销售的T载体的应用效果不够稳定，因为T核苷酸并非Taq DNA聚合酶优先聚合的核苷酸，仅部分载体的3’端能添加上T，并且有些末端可能被加上过多的T。市售T载体的另一个欠缺是基因表达功能较弱，PCR产物克隆成功后，还需要用限制性内切酶切下目的片段，亚克隆到经同样酶切处理的表达载体中，才能进行基因的超量表达研究。因此通常T载体只能作为中间载体，后续还要进行一系列繁琐的操作。 

钟星等最近发表了关于构建一种用于基因克隆和表达的定向T载体pETG的研究论文(钟星等，2012，生物工程学报，29：510-519)。本文中作者对TA克隆技术作了三方面的改进：(1)通过限制性内切酶Bfu I切割产生T载体，保证载体末端序列正确；(2)以表达载体pET-23a为基础，可用于基因的表达；(3)引入lacO序列鉴定PCR扩增的目标基因的正反向连接。该论文在构建自制的可用于基因表达的T载体方面，以及TA克隆的定向选择方面为基因工程工作者提供了有效的方法。但是，由于pET系统的表达载体本身的性质问题，所产生的T载体pETG在应用中表现有以下不足之处：(1)必须添加昂贵的化学诱导剂IPTG诱导基因的表达；(2)被诱导表达的许多外源基因易产生包涵体或细胞毒性，从而限制基因产物的活性或抑制转化子生长；(3)因为lacO的部分序列必须合成在引物上，定向筛选仅适用于PCR产物的克隆；(4)pET质粒分子较大，转化率相应较低，并且因基因反向插入，约有50％的转化子中的基因不能表达。 

大肠杆菌表达载体pHsh是本研究组发明的热激诱导型高效表达系统，2010年获得美国发明专利授权(US7,807,460B2)，相关技术在国内已经有论文综述(蒋钰瑶等，2012，微生物学通报，39：394-400)。热激载体pHsh与国际通用的pET等表达系统相比具有以下独特的优势：(1)避免添加化学诱导剂，降低成本减少污染；(2)通过激活分子伴侣的表达提高细胞生长密度和目标蛋白的可溶性；(3)pHsh是最小型的表达载体，容量大、转化率高，并且有利于对目标基因进行原位定点诱变或定向进化。但是，pHsh系统的质粒中还没有用于TA克隆的T载体，迄今还需要通过多克隆位点将外源基因克隆到pHsh载体中进行基因表达。这种方式不仅使工作繁琐，而且常常受限制性内切酶的匹配性的限制。本发明利用表达载体pHsh的优势，设计并构建一种兼有克隆、表达和目标基因活性筛选功能的高效T载体，pHsh-T。 

发明内容

1.发明目的