[发明专利]一种重组人胸腺肽α1的制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物制药技术领域中的一种重组人胸腺肽α1的制备方法。

背景技术

胸腺肽α1（Thymosinα1，Tα1），2010年进入中国药典后改名为胸腺法新。Tα1是一种酸性多肽，含有28个氨基酸，pI为4.2，相对分子量为3066kD（N端乙酰化的为3108kD），不含甲硫氨酸、半胱氨酸及芳香族氨基酸，无二硫键及糖基化，唯一的修饰是N端乙酰化，氨基酸序列如下：

N—Ser—Asp—Ala—Ala—Val—Asp—Thr—Ser—Ser—Glu—Ile—Thr—Thr—

Lys—Asp—Leu—Lys—Glu— Lys—Lys～Glu—Val—Val—Glu—Glu—Ala—Glu

—Asn—C。在Tα1的一级结构中存在丙一丙、丝一丝、苏一苏、赖一赖、缬一缬、谷一谷等 6处氨基酸重复序列，约占总量的一半，这在其他活性多肽中未曾见过。在水中Tα1无特殊的构型；在双十四烷基磷脂酰胆碱与二羟甲基丙酸(10：1)的单层囊泡、十二烷基硫酸钠溶液内或锌离子出现时，Tα1呈现部分空间构型；在疏水性较强的三氟乙醇中Tα1出现 2个区域特征，即 β转角和α螺旋，转角位于第5和 8个残基之间，α螺旋构型位于第 17和 24残基之间。随环境而发生的构型变化是胸腺肽α1与淋巴细胞相互作用所必需的，与调节免疫应答及淋巴细胞激活机制有关。

Tα1是一种生物反应调节因子，主要是T淋巴系统的免疫增强剂。Tα1可以恢复T淋巴细胞的功能并促进成熟T细胞的增殖，促进淋巴细胞在病原组织周围的聚集，促进淋巴因子及淋巴因子受体的产生。在临床上经常将Tα1作为免疫增强剂或免疫调节剂用于各种免疫缺陷病和免疫受抑制疾病的治疗，已应用于治疗乙肝、丙肝、癌症等疾病。

天然的Tα1其N端被乙酰化。有文献报道，去乙酰化的Tα1同样具有生物学活性。Tα1最早是Goldstin等从牛胸腺组织提取的胸腺素组份5（TF5）中分离出来的，现已用固相多肽合成技术成功合成，目前临床所用的Tα1制剂为化学合成制剂，而使用化学合成方法生产的N端乙酰化的Tα1，不仅成本高，价格昂贵，且制备要求条件高，污染环境等。

利用基因工程技术制备重组Tα1是解决上述问题的最佳途径。但是由于Tα1分子量较小，给制备重组Tα1带来一定的技术困难。如表达单体Tα1时，由于其分子量只有3.0kD，使其在下游的分离纯化过程中难度很大；亦有报道将Tα1_n（n为2-8）基因串联起来，表达n个串联的Tα1，后续采用裂解技术将其分为单体Tα1，如羟胺裂解、胰蛋白酶降解方法。由于胰蛋白酶降解方法不但成本高，而且特异性低，所以不适合工业化生产；羟胺裂解法由于条件剧烈，盐浓度要求高，导致蛋白溶解量很低，仅为0.02mg/ml，为后续的规模化生产带来困难。本发明提供的羟胺蛋白裂解方法可将蛋白溶解浓度提高到10mg/ml，大大提高了裂解效率和重组Tα1单体的产量。因此，研究开发一种重组人胸腺肽α1的制备方法是目前亟待解决的新课题。

发明内容

本发明的目的在于提供一种重组人胸腺肽α1的制备方法，该方法采用基因工程技术制备重组胸腺肽α1，以克服化学合成成本高且污染环境等缺点，解决了串联Tα1下游裂解浓度低的问题，不受自然资源的限制，可根据市场需求不限量的生产，具有投入少，产出高，利润空间大，作用机理独特，效果明显，无或低毒副作用。

本发明的目的是这样实现的：一种重组人胸腺肽α1的制备方法，所述方法包括步骤如下，

（1）人工合成胸腺肽α1四串体的全基因序列，具体设计为：在天然胸腺肽α1序列前面加上核酸限制性内切酶EcoRⅠ、羟胺切割位点天冬酰胺-甘氨酸对应的核苷酸；在每两个天然胸腺肽α1序列之间加上甘氨酸对应的核苷酸；在天然胸腺肽α1序列后面加上终止密码子、核酸限制性内切酶XhoⅠ对应的核苷酸；

（2）采用双酶切方法将胸腺肽α1四串体基因克隆至pGEX-4T-2质粒相应位点，构建融合表达载体pGEX-4T-2-4Tα1，将其转化至大肠杆菌得到基因工程菌，在IPTG诱导下以包涵体形式表达；

（3）重组胸腺肽α1的制备与纯化，具体方法是：重组胸腺肽α1四串体包涵体的溶解；重组胸腺肽α1四串体的纯化；重组胸腺肽α1四串体的裂解；重组胸腺肽α1单体的纯化；