[发明专利]鉴别棉花A genome和A sub-genome全套染色体的方法

说明书

技术领域

本发明属于分子细胞遗传学领域，具体涉及鉴别棉花A基因组和A亚基因组全套染色体的BAC-FISH方法。 

背景技术

细菌人工染色体荧光原位杂交（BAC-FISH）是将包含不同特性的BAC克隆直接定位到染色体上的技术，由于克隆的外源片段一般为100kb以上，其探针与靶DNA序列相遇的机会大，杂交信号检出率高。因此，它较单拷贝或低拷贝小片段DNA序列杂交更为容易检出信号，而且准确可靠。目前已被广泛应用于核型分析、基因定位、物理图谱的构建、比较作图及进化研究，其在植物基因组学和分子细胞遗传学研究中具有不可替代的作用。近年来，随着植物基因组测序的迅速发展，BAC-FISH在序列信息和染色体生物学间的桥梁作用也显得越来越重要。BAC-FISH首次在棉花领域的应用是在1995年（Hanson等）。随后，随着科技技术的不断改进成熟，尤其是棉花基因组学研究的深入，棉花高密度的遗传图谱以及BAC文库的成功构建，BAC-FISH在棉花上的应用逐渐广泛起来。 

棉花是世界上重要的经济作物，棉属共包含52个棉种，共5个四倍体和47个二倍体。棉花二倍体棉种分为A、B、C、D、E、F、G和K共8个染色体组。四倍体棉种为异源四倍体，其染色体组为AD。如今，世界范围内主要的栽培种是陆地棉（AD）和海岛棉（AD），分别占栽培面积的95%和5%左右。目前，D组棉种雷蒙德氏棉的基因组测序已经完成，A组棉种亚洲棉的基因组测序正在进行中。对棉花A、D组染色体的研究将会对四倍体棉的进化研究以及对棉花育种都会有很大的帮助。通过筛选BAC文库获得不同类型的特异BAC克隆，来进行荧光原位杂交实验，是一个研究染色体结构和染色体之间亲缘关系很好的方法。 

发明内容

本发明的目的是提供鉴别棉花A基因组和A亚基因组全套染色体的BAC-FISH方法。 

本发明首先筛选到鉴别棉花A基因组或A亚基因组染色体的FISH探针，该BAC克隆299N22由SSR引物NAU1201筛选海岛棉pima-90BAC（王文生，2006） 文库所得，SSR引物NAU1201的序列信息为： 

Forward Primer:CCGATATCTTACTTTCCAACCT 

Reverse Primer:AAGGGGTTTGAAGGGTTATC 

该引物扩增出的目的片段长度大约为150bp，序列为：CCGATATCTTACTTTCCAACCTCTTTCTTCCATCTCCATCTCCATCTCCTTTCTGCAATTATTCCCAACTTTCCATGGCTTCCTTCACACCCAATCTAGAACCTGCCCCTGACACCTCTCTTCAGTTCAAGCCCAAGAAACCCAGGATAACCCTTCAAACCCCTT 

用引物NAU1201扩增BAC克隆299N22可获得长度大约为150pb的目的片段。 

利用该BAC克隆做探针，在不同棉种有丝分裂中期的染色体上进行杂交试验，结果表明：在5个四倍体棉种的A亚组全套染色体及在2个A基因组棉种的染色体上均表现出信号，且信号分布在所有的染色体上，而四倍体棉种D亚基因组染色体无信号。 

根据本发明的具体实施方式，所述BAC-FISH方法包括以下步骤： 

1）取材及预处理：取种子在温水中浸泡12h左右，然后在光照培养箱里培养，待根长至1～2cm时，截取根尖用(25ppm)放线菌酮25℃下处理2h，然后用蒸馏水冲洗1次，用95%乙醇：冰乙酸（3:1）固定液固定2h到24h； 

2）酶解：取出固定好的根尖，用蒸馏水冲洗1次，在37℃下用2%纤维素酶+1%果胶酶混合液处理根尖45min； 

3）制片：用60%乙酸进行压片，保留下好的制片在-80℃下保存4h以上，然后在-80℃下揭掉盖片，迅速置于80℃烤干，在60℃烘箱中烘干10h，最后放在4℃保存备用； 

4）标记探针：探针的标记采用Bio-Nick Translation Mix系统标记，首先提取特异BAC克隆(299N22)的质粒，然后参考Roche公司的说明，先取1μL相应浓度的质粒溶解于ddH₂O中，配成16μL，再加入4μL Bio-Nick Translation Mix混合，短暂离心，然后15℃保温90min，最后是65℃温浴10min，以灭活体系中的酶活性，最后放在-20℃保存备用。 

5）进行荧光原位杂交。