[发明专利]一种制备耐盐嫁接苗的方法

说明书

技术领域

一种制备耐盐嫁接苗的方法，属于农林生物技术领域。可以广泛应用于农林、园艺等方面。

背景技术

我国拥有大量的盐碱地有待开发。选育耐盐碱植物新品种与改良土壤等是利用盐碱地的主要手段。有些生物具有天然的抗盐特性，它们拥有大量的耐盐基因，通过转基因手段可以获得转基因耐盐新品种。但由于公众对转基因食品安全、转基因植物花粉对环境的可能影响等担忧，转基因品种的推广受到了一定的限制。仅利用转基因耐盐材料作为砧木，非转基因材料作为接穗，从接穗上收获农产品等，就可以避免人们对这方面的担忧。

发明内容

通过功能基因组比对，克隆耐盐相关基因；构建耐盐基因的植物表达载体；选择农艺性状表现良好、适应性强、对接穗性状有良好主要的物种做砧木种源；通过农杆菌介导或其他手段转化该砧木种子；筛选与鉴定耐盐砧木幼苗；培育非转基因幼苗；耐盐转基因幼苗为砧木靠接、芽接或劈接非转基因接穗；培育嫁接苗，获得耐盐转基因种苗。

具体实施方式

1.通过功能基因组比对，克隆耐盐基因。

甜菜碱醛脱氢酶基因(BADH)来自于耐盐植物。该酶催化形成的小分子能改善细胞膜的耐盐能力。依据GenBank提供的核苷酸序列，两端引入各引入一个限制性内切酶识别学列，设计相关引物，从该耐盐植物基因组中PCR基因BADH片段；链接、测序比对正确，获得完整BADH基因。

2.构建耐盐基因的植物表达载体。

采用植物表达载体pCAMBIA1301，在其多克隆位点引入：35S启动子-BADH基因-Nos终止子外源DNA片段。T-DNA左右边界内含潮霉素抗性基因的完整表达框。表达载体通过热激法转入LB4404根瘤农杆菌中。

3.选择农艺性状表现良好、适应性强、对接穗性状有良好主要的物种做砧木种源。

购买了国内6个西瓜的主栽品种，在天津种植，观察它们的耐盐耐旱、抗病等性状，结果见表1。由此表1科长，2号作为砧木种源较好。

表1六个西瓜品种的农艺性状比较

4.通过农杆菌介导或其他手段转化该砧木种子。

2号西瓜种子经1-2Gy⁶⁰Co辐照后，浸泡在含上述表达载体的根瘤农杆菌LB4404中15-60min；浸泡种子在室内室温、自然光条件下萌发，定期喷洒含30-50mg/L潮霉素的灭菌水。

5.筛选与鉴定耐盐砧木幼苗。

20天后从幼苗的根、叶片上采样，一部分用于提取DNA，以BADH基因、Hyg(潮霉素抗性基因)的特异性引物进行PCR鉴定；一部分对报告基因GUS进行化学组织测定。统计阳性率，结果见表2。部分阳性植株移栽在玻璃温室0.6％的盐碱土中供嫁接使用。

表2辐照-根瘤农杆菌介导的西瓜幼苗转化率