[发明专利]沙漠齿肋赤藓实时荧光定量PCR内参分子的筛选方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种适用于沙漠藓类齿肋赤藓各种非生物胁迫下实时荧光定量PCR研究的内参分子的筛选方法。

背景技术

干旱，高盐等非生物胁迫是限制植物生长发育和作物产量的主要因素，每年导致作物减产达50%以上。随着全球气候变暖，温室效应和土地沙漠化的加剧，干旱问题将日益突出，干旱对农业生产的影响也将更加严重。目前，利用干旱胁迫相关基因提高植物的抗旱能力，已经成为植物抗逆分子生物学的研究热点和植物抗逆基因工程重要的研究方向。

干旱区植物在长期进化过程中积累的抗干旱基因资源是开展种质创新的源动力。干旱区严酷的自然环境孕育了特殊，天然，珍稀的逆境植物资源。荒漠极端耐旱藓类齿肋赤藓即为典型代表。齿肋赤藓(Syntrichia caninervis Mitt.)隶属丛藓科、赤藓属，为典型的变水植物，是构成藓类结皮的优势种，自然干燥状态下呈灰黑色，似一层“壳”分布在沙漠表面，形成有重要生态意义的苔藓生物结皮，不仅具有较强的抗逆能力，而且在维持荒漠生态系统的稳定性和受损生态系统的恢复重建中起着重要的作用。此外，一旦遇到降水，齿肋赤藓即在30s内迅速通过再水化过程而“复原”呈鲜活的绿色，并开始执行光合作用，其独特的生理特性及抗旱性和耐热性的分子调控机制已成为国内外相关科学的研究热点。同时，长期的环境压力使得该种具有极好的抗旱，抗高温等抵抗多种非生物胁迫的能力，其体内必定蕴含着丰富的抗逆基因资源。目前，从极端抗旱藓类齿肋赤藓中发掘优质抗逆基因资源已经展开，特别是齿肋赤藓转录组数据库的建立，更是为该种的基因研究提供了很好的平台。目前，从齿肋赤藓中克隆，分析ALDH，HSP70，DREB等家族基因的工作正在展开。而要了解齿肋赤藓的抗逆机制以及挖掘丰富的抗逆基因资源，很关键的一个方法就是要分离这些基因并迅速、准确地定量检测抗旱基因在各种非生物胁迫下的表达。传统的印迹杂交，生物芯片技术和RT-PCR等手段在实时、定量检测抗旱基因表达量上，或存在缺陷，或价格昂贵、费时费力。随着分子生物学各项技术的发展，实时荧光定量PCR已经成为目前基因表达定量检测的主要方法，该法不仅灵敏度高，样品消耗量少，能检测出低丰度靶基因表达量，定量线性宽，但是实时荧光定量PCR检测的准确性很大程度上依赖于筛选适合的内参基因对数据进行校正和标准化，从而避免不同标本在RNA的产量、质量及逆转录率上可能存在的差别。因此，合适稳定的内参基因的选择则是齿肋赤藓抗逆机制和抗逆基因研究的基础。

以往对内参基因的稳定性研究证实，任何一种内参基因的所谓恒定表达都只是在一定类型的植物或特定实验因素作用下的相对恒定，在其他类型的植物中或不同实验处理下稳定性则很可能是变化的。若盲目的参考别的物种中稳定的一个内参或或几个内参基因，一方面可能使基因表达的微小差异难以发现，另一方面可能得到错误甚至是相反的结论。近年来，内参基因的稳定性问题近年来越来越受争议和关注。随着人们对内参基因稳定行问题的越来越重视，目前，已开发出基于Excel程序多种软件，用于评价内参基因的稳定性和变异系数，其中应用最普遍的为GeNorm和NormFinder程序。

综上所述，荒漠极端耐旱藓类齿肋赤藓是研究沙漠藓类抗逆机制和挖掘优良抗逆基因的好材料。研究和筛选齿肋赤藓中最稳定的内参基因是进行该种基因定量研究（荧光定量PCR实验）的先决条件。近年来，做为极端抗旱藓类的齿肋赤藓的分子水平工作陆续展开，从齿肋赤藓中已克隆出一些抗逆基因，如乙醛脱氢酶基因ALDH21（NCBI登录号:GQ245973），特别是近年来本课题组对齿肋赤藓转录组，蛋白组等高通量测序结果的相继获得，更是加快了齿肋赤藓的分子研究工作。很多抗逆基因的特性和功能亟待研究，但关于该种的内参基因的序列资料未见报道，最合适内参分子的研究和筛选工作更是空白。因此，本发明就旨在找到一种在非生物胁迫条件下齿肋赤藓开展实时荧光定量PCR研究最稳定，最合适的内参分子的筛选方法，为以后大规模开展抗逆基因特性及功能研究奠定基础。

发明内容