[发明专利]肺炎衣原体热休克蛋白60的可溶性蛋白的制备方法及使用方法

权利要求书

1.一种肺炎衣原体热休克蛋白60的可溶性蛋白的制备方法，肺炎衣原体热休克蛋白60即cHSP60，该方法构建cHSP60的原核表达系统pET28a-cHSP60，制备cHSP60-组氨酸融合蛋白，SEQ ID NO：1，显示cHSP60-组氨酸融合蛋白的核苷酸序列；其特征在于：所述肺炎衣原体热休克蛋白60的可溶性蛋白的制备方法包括以下步骤：

步骤（1）

从肺炎衣原体Cpn AR39株基因中获取cHSP60的序列，设计引物序列；

引物序列：上游引物，5’-CCGCATATGGTCGCTAAAAACAT-3’；下游引物，5’-CCAGCTCGAGTTAATAGTCCATTCCTGCGC-3’；

步骤（2）

用RT-PCR法扩增cHSP60的cDNA，并将cHSP60与原核表达载体pET28a-c(+)连接，构建pET28a-cHSP60重组质粒；

RT-PCR法扩增体系为：模板cDNA为2.5μl，5’引物与3’引物各加0.4μl，2xTaq Plus PCR MasterMix为10μl，最后加双蒸水补足到20μl；

反应条件为：95℃预变性5分钟；95℃变性30秒，58℃退火30秒，72℃延伸90秒，进行30个循环；72℃延伸5分钟；

步骤（3）

经过克隆、酶切鉴定及核苷酸测序证实，获得重组的表达载体pET28a-cHSP60，经过IPTG的诱导在E.coli BL21菌株中产生cHSP60-His融合蛋白。

2.一种肺炎衣原体热休克蛋白60的可溶性蛋白的使用方法：其特征在于：按照诱导剂IPTG的浓度为1.0mM，诱导温度30℃，诱导时间6小时进行大规模诱导表达cHSP60-组氨酸标签融合蛋白鉴定cHSP60-组氨酸融合蛋白纯度，将纯化的cHSP60-组氨酸融合蛋白纯度加入观察细胞中，cHSP60诱导观察细胞产生炎症因子IL-6和TNF-α，其表达具有浓度依赖性以及时间依赖性，除此之外，cHSP60能够激活核因子κB亚基的活化和促分裂素原活化蛋白激酶通路；将野生型B6小鼠用3%戊巴比妥钠麻醉后，于气管内给予多粘菌素B处理过的cHSP60-组氨酸融合蛋白；小鼠保持直立位，以确保液体全部被吸入肺部，6小时后处理小鼠肺部细胞，证实cHSP60能有效激发小鼠肺部炎症反应。