[发明专利]1，3-二羟基丙酮高产菌株及其构建方法

权利要求书

1.1,3-二羟基丙酮高产菌株GOX205，其特征在于：是以氧化葡萄糖酸杆菌ATCC621H作为宿主，选择质粒pBBR1MCS-2作为载体，通过将编码甘油脱氢酶的sldAB基因转化进入宿主并进行表达的一种菌株。

2.权利要求1所述的1，3-二羟基丙酮高产菌株的构建方法，其特征在于：具体步骤如下：

（1）制备氧化葡萄糖酸杆菌染色体；

（2）扩增sldAB基因；

（3）pBBR1MCS-2质粒与sldAB基因的消化；

（4）DNA片段的纯化回收；

（5）载体pBBR1MCS-2片段和sldAB基因片段的连接；

（6）质粒的富集与提取；

（7）电转化法构建重组菌株GOX205；

（8）挑选转化子。

3.根据权利要求2所述的1，3-二羟基丙酮高产菌株的构建方法，其特征在于：具体步骤如下：

（1）制备氧化葡萄糖酸杆菌染色体：将氧化葡萄糖酸杆菌接种到含有5ml甘露醇液体培养基的试管中，30℃条件下振荡培养10-12小时；然后将培养液转移入1.5ml离心管中，12000rpm离心30-60秒后，弃上清液，沉淀用0.5ml无菌水重悬，然后12000rpm离心30-60秒，收集菌体；加190μl TE悬浮沉淀，并加10μl10%SDS，1μl20mg/ml蛋白酶K，混匀，37℃保温1h；加30μl5mol/LNaCl，混匀；加30μl CTAB/NaCl溶液，混匀，65℃保温20min；加入300μl体积比25：24：1的酚/氯仿/异戊醇抽提，5000rpm离心10min，将上清液移至干净离心管；加入300μl体积比24：1的氯仿/异戊醇抽提，取上清液移至干净管中；加300μl异丙醇，颠倒混合，室温下静止10min，沉淀DNA；5000rpm离心10min，沉淀DNA，加入500μl70%乙醇，5000rpm离心10min，弃乙醇，自然风干；溶解于20μlTE，于-20℃保存备用；

（2）扩增sldAB基因：以氧化葡萄糖酸杆菌染色体作为模板，根据氧化葡萄糖酸杆菌染色体中sldAB基因序列设计引物，上引物为sldab-fw：catggatccaacgccagtttgctctg，下引物为sldab-re：catgaattccacctccgaccgtcat分别在上下引物两端添加HindⅢ、EcoRⅠ限制性内切酶酶切位点，以PCR方法扩增sldAB基因，PCR体系为50μl：上下引物均为1μl,200M的dNTP4μl,缓冲液5μl，步骤（1）所述氧化葡萄糖酸杆菌染色体模板为0.5μl，双蒸水38.25μl，聚合酶0.25μl；PCR扩增条件为：94℃预变性4min；94℃变性30sec；55℃退火30sec，72℃延伸3min，得到PCR扩增产物sldAB基因；

（3）pBBR1MCS-2质粒与sldAB基因的消化：将扩增的sldAB基因片段4μl与pBBR1MCS-2质粒4μl分别用限制性内切酶HindⅢ、EcoRⅠ各加入0.25-0.5μl，10×酶缓冲液2μl，用无菌水将总体积补充到20μl，放于37℃条件下消化1-2小时；

（4）DNA片段的纯化回收：将步骤（3）中的sldAB片段和载体pBBR1MCS-2的双酶切产物分别从琼脂糖凝胶上切下，分别利用试剂盒进行纯化回收；首先向凝胶块的管中加入2-5倍体积溶胶液，46-50℃水浴放置5-15分钟，300rpm振荡，使琼脂糖凝胶完全溶解，然后加到一个吸附柱中，13000rpm离心5分钟，倒掉收集管中的废液；加入700μl漂洗液，13000rpm离心5分钟后弃废液，重复该步骤；取出吸附柱，放到离心管中，加入洗脱缓冲液30μl，室温放置1分钟，13000rpm离心3分钟，得到纯化后的DNA片段；

（5）载体pBBR1MCS-2片段和sldAB基因片段的连接：在20μl连接体系中，加入2μl10×T4连接酶缓冲液，1μlT4连接酶，载体pBBR1MCS-2片段和sldAB基因片段的加入量分别为5-7μl和6-8μl，加水至20μl体系，在16℃条件下连接2-3小时后，通过酶切验证得到pBBR1MCS-2-sldAB质粒；

（6）质粒的富集与提取：将经过酶切验证的连接产物转化到提前制备成感受态的大肠杆菌DH5α中，转化子在LB-卡那霉素固体培养平板上被筛选出来，进而通过菌落PCR和双酶切实验进行验证，得到pBBR1MCS-2-sldAB质粒；利用常规方法提取质粒；

（7）电转化法构建重组菌株GOX205：

（a）制备电转化感受态细胞：将氧化葡萄糖酸杆菌ATCC621H接种于装有50ml电转化培养基的500ml摇瓶中，将摇瓶放于30℃，200rpm的摇床中培养至培养液在600nm的吸光度达到0.4；将细胞通过在4℃，6000rpm条件下离心4min进行收获，并在30ml的灭菌过的10%（v/v）甘油中重悬，细胞用冷的10%（v/v）甘油洗三次，最后重悬于2ml10%（v/v）甘油中；

（b）取400μl电转化感受态细胞用于电转化，每管感受态细胞加入1μlpBBR1MCS-2-sldAB质粒，用移液器轻轻吸打均匀，置冰上；

（c）将要转化的混合物加入预冷的1mm的电转化杯中，立即按下按钮电击，脉冲电压2000v；

（d）立即加800-1000μl甘露醇培养基到转化杯中重悬细胞；

（e）将细胞转入合适的培养管中置于30℃摇床中培养3-5小时；

（f）吸取100-200μl的菌液涂布到甘露醇-卡那霉素固体培养基平板上，30℃条件下培养3-5天；

（8）挑选转化子：挑出在甘露醇-卡那霉素固体培养基平板上上生长的单菌落，通过菌落PCR和双酶切实验进行验证得到转化子。