[发明专利]基于微流控技术的成骨细胞电刺激系统及其操作方法

说明书

技术领域

本发明涉及细胞体外微环境重建技术领域，尤其涉及一种基于微流控技术的成骨细胞电刺激系统及其操作方法。

背景技术

骨不愈合或延迟愈合是骨折后的严重并发症，骨形成障碍是其主要原因之一。骨形成是一个复杂现象，是指间充质成骨细胞祖细胞通过募集和复制，进一步分化为前成骨细胞及成熟成骨细胞，最终导致细胞外基质的积聚和矿化的过程。在此过程中成骨细胞起了关键作用，因此研究如何促进成骨细胞的增殖是十分重要的。

近年来，很多学者证实多种刺激方法均可促进成骨细胞的增殖，如电、微波振动、冲击波、磁场作用等。其中，电刺激方法的刺激来源更容易得到，而且已经有许多实验结果证明电刺激可明显促进成骨细胞的增殖及分化，对促进骨愈合的研究有重要作用，因此成骨细胞的电刺激研究是十分必要的。

明斯特大学的Wiesmann教授于2000年证实了电刺激能够促进成骨细胞的生物矿化过程(biomineralization process)。成骨细胞接受电刺激后，矿物质分泌过程明显加强。首尔大学的In Sook Kim等人于2005年研究调查两相电流刺激对鼠颅盖骨的成骨细胞增殖、分化、合成细胞因子的影响。在此研究中，给予成骨细胞1.5μA/cm²、3000Hz的电刺激。结果表明持续电刺激后成骨细胞增殖31％，而间断电刺激没有明显变化。实时监测RT-PCR和ELISA表明血管内皮生长因子(VEGF)于电刺激后明显上调。从而得出结论两相电流刺激可促进细胞增殖，诱导VEGF的产生。该项研究证实了电刺激的有效性。曼彻斯特大学的Griffin教授于2010年利用一种电刺激装置，采用不同的电信号对成骨细胞产生电刺激，证实了不同电信号对成骨细胞的增殖和矿化过程具有不同程度的促进作用。

上述几个发现和结论均通过宏观实验获得，并不能准确评估电刺激对成骨细胞的影响效果，而且电刺激促进成骨细胞增殖的机制尚不完全明确，这也限制了对成骨细胞电刺激影响的进一步研究。

微流控技术又称为“芯片实验室”，是在微观尺寸下控制和检测流体的技术。由于其具有通道尺寸与人体细胞大小相匹配，网络结构与生理状态下细胞的空间特征相接近以及多种单元灵活组合等优点已经广泛用于细胞生物学研究。通过微流控技术研究电成骨细胞更接近于生理状态，更有利于揭示电刺激对成骨细胞的影响及潜在机制。基于微流控技术的成骨细胞电刺激方法为体外生长的细胞提供更加贴近体内的局部微环境，为细胞生物学提供新的研究方法。

东京大学的Kihoon Jang等人于2007年提出一种用于药物筛选的成骨细胞3D微流控芯片。该微流控芯片的微通道呈线形，长6cm，宽200μm，深100μm，每个通道的有效区为0.31cm²。通过此系统用很少量的细胞即获得了预期的实验结果。该研究说明了通过微流控技术研究成骨细胞的可行性。布朗大学的Ercan教授于2009年提出一种在微纳米管内实现成骨细胞电刺激的方法。该方法中，在微纳米管表面镀一层经过阳极化处理的金属钛，连接信号源后给予管内的成骨细胞电刺激。该研究可以说明在该条件下电刺激对成骨细胞行为的影响。

尽管已经有不少学者通过微流控技术对成骨细胞实施刺激并观察细胞反应，但这些实验与方法均无法对单个成骨细胞进行分析，也无法准确评估不同电势差对单个成骨细胞的影响效果。

发明内容

(一)要解决的技术问题

鉴于上述技术问题，本发明提供了一种基于微流控技术的成骨细胞电刺激系统及其操作方法。

(二)技术方案

本发明基于微流控技术的成骨细胞电刺激系统包括：微流控芯片，由透明材料制备，具有一用于承载细胞培养基，为成骨细胞的培养提供空间环境的微沟道，该微沟道的两端分别设置入口和出口；倒置显微镜，其镜头从微流控芯片的底部对准微沟道的中部；两弹性密封塞，分别塞住微沟道的入口和出口；电刺激信号源，用于提供电刺激信号，其两电极分别穿过两弹性密封塞后伸入微沟道内的细胞培养基液面下。

根据本发明的另一个方面，提供了一种上述成骨细胞电刺激系统的操作方法。该操作方法包括：步骤S102，对微流控芯片进行灭菌消毒；

步骤S104，将经过灭菌的微流控芯片置于培养皿内，用移液枪将细胞培养基和成骨细胞分别注入微沟道；步骤S106，封堵微流控芯片上微沟道的入口和出口，为成骨细胞培养提供培养环境，将成骨细胞培养至贴壁；以及步骤S108，在微流体沟道入口及出口分别插入电极，确保连接紧密后，连接并打开电刺激信号源，给予相应电刺激。

(三)有益效果