[发明专利]鹿牛羊马驴猪动物皮组织DNA的PCR鉴定用引物体系

说明书

技术领域

本发明涉及分子生物学领域，尤其涉及鹿、牛、羊、马、驴和猪动物皮组织DNA的PCR鉴定用引物体系及PCR鉴定方法，以及相应的试剂盒，适用于上述六种动物皮组织及其制品的快速检测及鉴定，尤其适用于鹿皮及鹿皮胶的快速防伪鉴定。

背景技术

鹿皮是我国的传统中药，药用历史悠久。早在《本草纲目》中就有鹿皮“补气，涩精，敛疮”功效的记载；《四川中药志》中也记载了其“能补气，涩虚滑，治妇女白带，血崩不止，肾虚滑精，涂一切疮”。以梅花鹿或马鹿的皮为原料加工精制而成的鹿皮胶富含多种氨基酸与微量元素，具有补血止血、补肾壮阳等多种营养保健作用。《北京市中药炮制规范》描述鹿皮胶味咸，性温，归肝，肾经，主治补气，涩虚精，强筋健骨，可用于身体瘦弱，腰酸耳鸣，头晕目眩，虚弱久咳，痰中带血，虚喘气短，妇女经血不调，崩漏带下，性偏于温，既能补阳，又可滋阴补血、止血。

利用现代技术测定鹿皮胶成分[张潇予，徐厚平，刘代成，鹿皮胶的成分分析，山东师范大学学报，2010，25（4）]，发现其中包括8种必需氨基酸，包括赖氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、苏氨酸、色氨酸，均为人类不能自身合成的必需氨基酸，对于身体发育、新陈代谢都具有重要作用。将鹿皮胶的氨基酸组成与阿胶（即驴皮胶）进行对比，结果显示二者基本一致。这些都说明鹿皮胶与阿胶一样，具有很大的药用保健价值及市场价值。然而对鹿皮产品完整的科学数据，特别是特型鉴定方面的数据尚无处可查，尤其是当鹿皮、驴皮等原材料制成皮胶产品后单单利用传统目测及理化分析并不能很有效地判别这些性质十分相似的皮胶样品。

在这种情况下，利用高科技的技术建立分子生物学鉴定手段，能够为人们提供经现代科学技术鉴定的高质量鹿皮及鹿皮胶产品。现代分子生物学技术具有可靠、灵敏、快速的特点，尤其是对于干燥、加热、蒸煮等处理过的样品仍旧能保持检测的准确性。利用聚合酶链式反应（PCR）技术可以从微量DNA样品中灵敏地扩增出特定的DNA片段，并且通过引物序列的差异来有效保证反应的特异性。因此PCR技术被广泛应用于物种鉴定、检测等领域，在防止假冒、掺假、保证产品质量、维护消费者权益方面发挥了巨大的作用。

本公司公开号为CN103424546A的中国专利公开了鹿皮胶中所含鹿皮胶特异DNA序列的PCR扩增实验鉴定。目前国内外尚无鹿皮及鹿皮胶PCR鉴定的其他专利/文献可循。另外，对于多个常见物种（包括牛羊马驴猪等）动物皮组织DNA的PCR同步鉴定方法尚没有建立，例如公开号为CN102747167A的中国专利采用PCR的方法用于鉴定阿胶，就只是区分了驴皮及马皮/骡皮。这样容易造成物种的漏检，不能有效防止假冒、掺假现象。因此，建立鹿及常见物种动物皮组织DNA的PCR鉴定方法十分必要。

本公司前期申请的发明专利（CN102876805B）建立了鹿及猪牛羊马驴兔鸡常见物种动物血液DNA的PCR鉴定技术。但是由于皮肤组织与血液的DNA组成差别巨大，血液中占绝大比例的红细胞不含基因组DNA，仅白细胞含有少量基因组DNA；而皮肤组织中基因组DNA占绝大比例，因此DNA成分更为复杂，极易对PCR结果造成干扰。实验检测中也证实了非特异性干扰的存在。因此本发明在前述发明的基础上，针对鹿及牛羊马驴猪常见物种动物皮组织DNA的PCR条件进行了优化，并且对马、猪两个物种的鉴定引物进行了重新设计及有效性验证。

发明内容

为了克服上述现有技术中存在的不足，本发明提供了一种鹿牛羊马驴猪动物皮组织DNA的PCR鉴定用引物体系，该引物体系及基于该引物体系进行的鉴定方法可快速且高特异性的检测鹿牛羊马驴猪动物皮制品的真伪及其是否有掺假，尤其适用于鹿皮和鹿皮胶产品鉴定与检测，其对常见物种的检测覆盖面广泛，可信度高。

本发明为了解决其技术问题所采用的技术方案是：

一种鹿牛羊马驴猪动物皮组织DNA的PCR鉴定用引物，由下列引物对组成：

（1）对鹿12S rRNA基因进行扩增生成鹿特异性扩增片段的引物对Ⅰ：

正向引物：5’-GCCTTCCTATTGACCCTTAATAG-3’

反向引物：5’-AGCGGCTGTAAAGTTACTTTCGT-3’；

（2）对牛Cytb基因进行扩增生成牛特异性扩增片段的引物对Ⅱ：

正向引物：5’-CCCTCTTACTAATTCTAGCTCT-3’

反向引物：5’-GTCCGATGGTGATATATGGGTG-3’；

（3）对羊Cytb基因进行扩增生成羊特异性扩增片段的引物对Ⅲ：