[发明专利]一种水貂肠炎病毒重组亚单位疫苗及其制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种水貂肠炎病毒重组亚单位疫苗及其制备方法。该疫苗是一种应用昆虫杆状病毒表达系统生产的重组亚单位疫苗，具有抗水貂病毒性肠炎作用的疫苗，属于兽用生物制品及生物技术领域。

背景技术

水貂病毒性肠炎(Mink Viral Enteritis，MVE)是由水貂肠炎病毒(Mink Enteritis Virus，MEV)引起的一种急性、高度接触性传染疾病，该病以腹泻为主要特征，具有较高的发病率和死亡率。

MEV在分类上隶属于细小病毒科(Parvoviridae)，细小病毒属(Parvovirus)。MEV感染水貂后，可引起水貂的肠黏膜炎症、坏死，继而引发水貂的剧烈腹泻，该病的发病急、致死率高(闫喜军，柴秀丽，吴威，等.水貂肠炎细小病毒分离鉴定.畜牧与兽医.2007,39(3):52-53.)。MEV可感染各年龄段的水貂，对幼貂的感染性极强。1949年，Schofield于加拿大最早报道了该病。Wills于1952年分离鉴定了该病原，并为该病毒命名。随后该病陆续在世界其它养貂国暴发，美国、丹麦、法国、英国、日本等国相继有该病暴发的报道(廖国安.水貂病毒性肠炎.中国畜禽传染病.1990,2:53-56.)。该病是世界公认的危害水貂饲养业较大的病毒性传染病之一，给养貂业带来了巨大的经济损失(闫喜军，张海玲，柴秀丽，等.水貂肠炎细小病毒结构蛋白VP2基因的克隆和序列分析.特产研究.2008,47(4):1-6.)。同其他病毒病一样，水貂病毒性肠炎的防治也主要以预防为主。目前用于水貂病毒性肠炎的疫苗主要是灭活疫苗。

目前防治MEV的常规疫苗主要为灭活疫苗。常用的是MEV铝胶甲醛灭活苗。取猫肾原代细胞(CRFK)或猫肾细胞(F81)用胰蛋白酶消化。培养液为含10％牛血清的乳蛋白。这种疫苗的优点是安全性较好，副作用较小，但因其灭活使用的甲醛对抗原蛋白具有一定的破坏作用及灭活后的MEV病毒不能够在水貂体内增殖，因此免疫期短，需要多次免疫；为达到好的免疫效果常选用强毒株，因此需严格的灭活操作，假若灭活效果不理想，存在散毒的风险；灭活疫苗不能诱导产生局部IgA，粘膜免疫防御能力较弱。

基因工程亚单位疫苗是利用基因工程技术，构建连有保护性抗原编码基因的表达载体，在细胞或菌体中表达目的蛋白，经提纯加工抗原蛋白制成的疫苗(J A Lopez de Turisod,S E Corte,C Martinez,et al.Recombinant Vaccine for Canine Parvovirus in Dogs.Journal of Virology.1992,66(5):2748-2753.)。

理想的MEV疫苗的一个重要标准就是成本低。使用杆状病毒表达系统在昆虫细胞系获得高产率的重组VP2为MEV疫苗提供了一种新的选择。众所周知，应用生物反应器大规模培养昆虫细胞系既困难又昂贵，只有解决相关技术难题，如培养基成本、高密度高表达、生物反应器放大技术，才能够使该疫苗的商业化成为可能。

MEV粒子为直径20～24nm的轴对称的二十面体结构，无囊膜，粒子内含有单股负链DNA。MEV的基因组大约为5kb，分子量约为1.5～2.0×10⁶kD(T Kariatsumari,M Horiuchl,E Hama,et al.Construction and nucleotide sequence analysis of an infections DNA clone of the autonomous pavovirus,mink enteritis virus.Journal of General Virology,1991,72:867-875.)。在其基因组中有两个主要的开放阅读框架，它们分别编码结构蛋白(VP1和VP2)和非结构蛋白(NSl和NS2)。MEV无囊膜，不含糖类和脂质，结构坚实紧密。MEV对温度不敏感，65℃保温30min，病毒仍然可以感染水貂。

病毒样颗粒(VLPs)是亚单位疫苗半成品的功能性成分，它模仿病毒粒子的整体结构，却不含有传染性遗传物质。事实上，许多病毒样颗粒完全缺乏DNA或RNA病毒的基因组，只拥有和灭活、减毒病毒疫苗所含病毒衣壳蛋白相近的构想。通常情况下，仅较低剂量的病毒样颗粒模仿的病毒粒子结构做为抗原免疫宿主，便足以引起和病毒性疫苗所产生的类似的保护性反应。除了它们能激发B细胞介导的免疫反应，也已被证明是非常有效的刺激CD4增殖反应和细胞毒性T淋巴细胞(CTL)响应的抗原物质。