[发明专利]用于检测H7N9亚型流感病毒的引物组合及检测试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及H7N9亚型流感病毒的检测，具体地说，涉及一种用于检测H7N9亚型流感病毒的引物组合及含有所述引物组合的检测试剂盒。

背景技术

甲流病毒可引起鸟类和一些哺乳类动物的流感，属于正黏液病毒科。在鸟类中已经分离得到所有甲流病毒亚型病毒株，其中一些亚型可以在家禽及人类中引发严重的流感。

甲型流感病毒是负义单链RNA病毒，根据病毒薄膜表面血凝素（hemagglutinin，HA）和神经氨酸酶（neuraminidase，NA），可分为不同的亚型。目前已发现17种不同的血凝素（H1到H17）和9种不同的神经氨酸酶（N1到N9），所以理论上存在153种不同的组合。最新的H17抗原类型是2012年在果蝠中分离得到的。H7N9亚型禽流感病毒是其中的一种，以往仅在禽间发现，未发现过人的感染情况。

在H7N9病毒之前，已经有11种甲型流感病毒感染人类，它们分别是H1N1、H2N2、H3N2、H5N1、H7N7、H1N2、H9N2、H7N2、H7N3、H5N2和H10N7。

2013年中国出现了人感染H7N9亚型禽流感病例。H7N9型禽流感是一种新型禽流感，于2013年3月底在上海和安徽两地率先发现。H7N9型禽流感是全球首次发现的新亚型流感病毒，尚未纳入我国法定报告传染病监测报告系统，且截至2013年4月初尚未有疫苗推出。被该病毒感染均在早期出现发热等症状，目前为止尚未证实此类病毒是否具有人传染人的特性。经调查，H7N9禽流感病毒基因来自于东亚地区野鸟和中国上海、浙江、江苏鸡群的基因重配。截至2013年4月23日，全国共报告105例确诊病例，其中死亡21人，康复13人，其余71人正在各定点医疗单位接受救治。

对H7N9亚型流感病毒片段的重配研究结果显示，H7N9禽流感病毒的8个基因片段中，H7片段与浙江鸭群中分离的禽流感病毒相似，浙江鸭群中的病毒往上追溯，与东亚地区野鸟中分离的禽流感病毒基因相似；N9片段与东亚地区野鸟中分离的禽流感病毒相似。其余6个基因片段与H9N2禽流感病毒相似。据病毒基因组比对和亲缘分析显示，H9N2禽流感病毒来源于中国上海、浙江、江苏等地的鸡群。基因重配的发生地很有可能在中国的长三角地区，过程可能是亚欧大陆迁徙的野鸟（携带病毒）在自然迁徙过程中（经由韩国等东亚地区）和中国长三角地区的鸭群、鸡群携带的禽流感病毒进行基因重配而产生。鸭群、鸡群可能大量携带的禽流感病毒而不发病。

因此，开发一种快速简便、特异性及灵敏度高、低成本、结果稳定的H7N9亚型禽流感鉴定方法成为亟待解决的问题。

发明内容

本发明的目的是提供一种用于检测H7N9亚型流感病毒的引物组合及检测试剂盒。

为了实现本发明目的，本发明的一种用于检测H7N9亚型流感病毒的引物组合，所述引物组合包括特异性扩增H7N9亚型流感病毒HA基因的引物对I以及特异性扩增H7N9亚型流感病毒NA基因的引物对II。

引物对I：

H7F：5’-GGCCAGTATTAGAAATAACACCTATGA-3’(Seq ID No.1)

H7R：5’-GCCCCGAAGCTAAACCAAAGTAT-3’(Seq ID No.2)

引物对II：

N9F：5’-TCTGAATGTGTATGCCACAAC-3’(Seq ID No.3)

N9R：5’-TGAGCCCTGCCAATTGTCCC-3’(Seq ID No.4)

本发明还提供含有上述引物组合的用于检测H7N9亚型流感病毒的试剂盒。优选地，所述试剂盒还包括dNTPs、Taq DNA聚合酶、Mg²⁺、PCR反应缓冲液中的一种或多种。更优选地，所述试剂盒还包括标准阳性模板。

本发明还提供利用上述引物组合或检测试剂盒鉴定H7N9亚型流感病毒HA和NA基因的方法，该方法为：以待测样品核酸（如cDNA、DNA）为模板，采用上述引物组合对H7N9亚型流感病毒HA和NA基因进行PCR扩增（可在同一PCR反应管内进行，实现双重检测），然后采用2%琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物，当扩增产物出现132bp的特异性扩增条带（Seq ID NO.5）时判断为H7亚型HA基因，当扩增产物出现213bp的特异性扩增条带（Seq ID NO.6）时判断为N9亚型NA基因。