[发明专利]一种昆虫触角及附肢的扫描电镜样品处理方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种昆虫触角及附肢的扫描电镜样品处理方法，属于实验样品处理技术领域。

背景技术

触角和附肢是昆虫的重要感觉器官，它们上面着生有许多不同种类的感受器，而昆虫感受器是特化的表皮部分，为昆虫感受器官的最基本结构单元和昆虫机体感知外部环境，进行化学通讯的信息接收装置。通过昆虫感受器，昆虫能够感受寄主植物中的挥发性化合物，并将此作为交配、觅食和寻找生殖场所的信息，根据这一特性可以用来监测和诱杀昆虫。利用昆虫信息素调控害虫行为是一种无公害的害虫控制技术，昆虫在求偶、觅食、聚集等活动中常常借助化学气味物质传递信息，而感受这些信息的主要器官是分布在触角及附肢上的化学感受器。在昆虫的种间和种内化学通讯、声音通讯及触觉通讯中，昆虫感器起着重要的作用，通过触角及附肢表面不同类型的感受器，昆虫机体可感知外界环境、进行求偶和取食。在植物与昆虫间的化学通讯中，昆虫感器也起着决定性的作用，它调控着昆虫的多种行为,诸如引诱昆虫趋向寄主植物，刺激昆虫取食，引导昆虫选择产卵场所，进行传粉和防御昆虫等。因此，明确昆虫的感器种类，特征及分布，以期深入了解其化学感受系统，为研究其化学通讯系统提供组织学和形态学依据，并为进一步研制昆虫引诱剂或行为干扰剂奠定基础，从而达到防治害虫的目的奠定理论基础。

扫描电子显微镜，是自上世纪60年代作为商用电镜面世以来迅速发展起来的一种新型的电子光学仪器，是一种利用电子束扫描样品表面从而获得样品信息的电子显微镜。它能产生样品表面的高分辨率图像，且图像呈三维，扫描电子显微镜能被用来鉴定样品的表面结构。在扫描电镜实验中，多数昆虫成虫活泼，幼虫多数形体较小，而触角和附肢等器官难以获得完整样品，而该类样品表面覆盖鳞片，体壁骨化程度高，组织致密，且多数昆虫体表背覆蜡质层，造成电镜处理中样品前处理困难。

发明内容

本发明的目的在于提供一种昆虫触角及附肢的扫描电镜样品处理方法，解决了昆虫触角及附肢扫描电镜前期处理中，触角及附肢鳞片去除不完全，样品表面清洗不彻底，无法去除昆虫触角及附肢蜡质层，固定液浸透困难，样品变脆易折断等问题。

 

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种昆虫触角及附肢的扫描电镜样品处理方法，包括以下步骤：

（1）样品固定液、清洗液、麻醉液的准备

a. 样品固定液：按重量百分比，戊二醛－甲醛磷酸盐缓冲液组成为戊二醛1-4%，甲醛30-45%，余量为磷酸盐缓冲液；

b. 样品清洗液：

清洗液Ⅰ：配制0.05mol/L的碳酸氢钠溶液，调PH至10，然后加入占碳酸氢钠溶液体积2.5-5%的蛋清，即得清洗液Ⅰ；

清洗液Ⅱ：其成分组成为氯化钠6.0-7.2g，次氯酸钠0.12-0.16g，氯化钙0.12-0.14g，氯化钾0.11-0.15g和蒸馏水1L；

c. 样品麻醉液：

配制50%的酒精水溶液，加入乙醚，使乙醚最终体积浓度达到1.2-3.5%；

（2）麻醉昆虫：用指形管扣住成虫，用镊子夹住棉球蘸麻醉液，棉球堵住平放的管口完全麻醉昆虫；

（3）解剖昆虫：在昆虫解剖显微镜下，用镊子和解剖剪剪取步骤（2）处理后的昆虫的完整触角及附肢；

（4）固定样品：将解剖后的样品迅速投入装有固定液的离心管中离心，直到样品完全到达固定液液面以下；接着摇床振荡，使得固定液与样品混匀，置于室温下固定2-8h；

（5）清洗样品：经步骤（4）固定后的样品，轻移到步骤（1）新制的清洗液Ⅰ中，边浸泡边在摇床上振荡，第一次振荡20-40min；第二次及以后清洗换取清洗液Ⅱ，每次振荡10-15min，直到在解剖显微镜下看不到触角及附肢上的鳞片或者在最后一次清洗废液中看不到表层蜡质层漂浮；最后用双蒸水洗2-4次，每次5-10min；

（6）样品脱水：乙醇梯度脱水，然后置于100%乙醇保存；

（7）粘样观察：用小毛笔小心轻取触角或者附肢样品，双面胶粘样，面朝上，通风橱中挥发完毕酒精，接着昆虫解剖显微镜初步观察，微调使得样品暴露部分各尽可能在同一平面上，然后上扫描电镜观察。