[发明专利]一种动态调控苏氨酸外排转运蛋白基因表达生产L-苏氨酸的方法

说明书

本发明公开了一种动态调控苏氨酸外排转运蛋白基因表达生产L‑苏氨酸的方法本发明提供了一种构建重组菌的方法，包括如下步骤：将突变苏氨酸操纵子thrA^C1034TBC表达元件、阻遏蛋白基因表达元件和苏氨酸外排基因表达元件导入目的菌中，得到重组菌；所述苏氨酸外排基因表达元件包括苏氨酸外排基因、驱动该基因表达的诱导型启动子和位于二者之间的调控元件Ocmt。本发明的有益效果在于，根据基因表达对发酵对数期和稳定期苏氨酸生产的具体作用，有针对性的提出了苏氨酸外排转运蛋白基因的表达控制策略，开辟并且实践证明了新的提高苏氨酸的发酵量的方式，从而在实践上可用于细菌发酵生产苏氨酸，便于推广应用。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，属于氨基酸发酵领域，具体涉及一种动态调控苏氨酸外排转运蛋白基因表达生产L-苏氨酸的方法。

背景技术

L-苏氨酸是一种人体必需氨基酸，广泛应用于医药、食品、动物饲料等方面。近年来，国内外市场对L-苏氨酸的需求量逐年增长。

发酵法是目前工业化生产L-苏氨酸的主要方法，而高生产性能菌种的构建是发酵生产苏氨酸的关键。在菌种构建的过程中，普遍采用过表达苏氨酸操纵子的方法增强苏氨酸的合成途径。当胞内苏氨酸产量积累到一定浓度时，胞内高浓度的苏氨酸会反馈阻遏和抑制苏氨酸合成途径的关键酶，甚至激活苏氨酸的降解途径。苏氨酸外排则成为限制苏氨酸高效合成的步骤，因此需要加速苏氨酸向胞外转运，进一步提高菌种的苏氨酸生产性能。在公开的文献中已经鉴定出多种苏氨酸外排转运蛋白基因，如大肠杆菌的苏氨酸外排蛋白基因rhtA、rhtB和rhtC，谷氨酸棒杆菌的thrE基因等。在已公开的苏氨酸发酵生产技术中，通过简单的过表达上述苏氨酸外排转运蛋白基因可以提高苏氨酸的产量。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种构建重组菌的方法。

本发明提供的方法，为如下A或B：

A所示的方法包括如下步骤：将阻遏蛋白基因表达元件和苏氨酸外排基因表达元件导入出发细菌中，得到重组菌；

B所示的方法包括如下步骤：将阻遏蛋白基因表达元件、苏氨酸外排基因表达元件和突变苏氨酸操纵子表达元件导入出发细菌中，得到重组菌；

所述苏氨酸外排基因表达元件包括苏氨酸外排基因、驱动苏氨酸外排基因表达的诱导型启动子和位于二者之间的调控区；

所述阻遏蛋白基因表达元件包括阻遏蛋白基因及驱动阻遏蛋白基因表达的启动子；

所述突变苏氨酸操纵子表达元件包括突变苏氨酸操纵子和驱动突变苏氨酸操纵子表达的启动子。

上述方法中，

B所示的方法中，所述导入方式为如下1）或2）：

1）将所述阻遏蛋白基因表达元件、所述苏氨酸外排基因表达元件和所述突变苏氨酸操纵子表达元件通过重组载体A导入出发细菌中，得到重组菌；

2）将所述阻遏蛋白基因表达元件和所述苏氨酸外排基因表达元件通过重组载体B导入出发细菌中，且将所述突变苏氨酸操纵子表达元件通过同源重组导入所述出发细菌中，得到重组菌。

上述方法中，1）中，所述重组载体A为将所述阻遏蛋白基因表达元件、所述苏氨酸外排基因表达元件和所述突变苏氨酸操纵子表达元件插入表达载体中得到的载体；

2）中，所述重组载体B为将所述阻遏蛋白基因表达元件和所述苏氨酸外排基因表达元件插入表达载体中得到的载体；

所述同源重组为将突变苏氨酸操纵子表达元件以含有突变苏氨酸操纵子表达元件的片段的形式同源重组到所述出发细菌中。

上述方法中，所述苏氨酸外排基因为rhtC或rhtC和rhtB或rhtC、rhtB和rhtA；