[发明专利]对能够发酵混合底物的生物的选择

说明书

本发明是申请日为2009年3月10日、申请号为200980108725.X、题为“对能够发酵混合底物的生物的选择”的申请的分案申请。

发明领域

本发明涉及用于选择能够经改进地消耗混合底物的生物菌株的方法。本发明还涉及通过这类方法选择的生物菌株，以及通过所述选择方法鉴定的生物菌株在发酵方法中的用途。

发明背景

木质纤维素原料如玉米秆、废木料、甘蔗渣是巨大但是大多尚未开发的可再生碳源的例子。许多可再生原料中主要的聚合物是纤维素，所述纤维素在水解后产生葡萄糖。然而，取决于讨论的原料，当半纤维素和果胶被水解时释放其它六和五碳源(例如木糖和阿拉伯糖)的大级分。这使得混合底物发酵成为必需。

混合的糖发酵比标准纯底物方法更加复杂。调节性事件，例如转运竞争或抑制、诱导、阻抑和分解代谢物失活，能够由于两阶段生长和滞后而提高发酵时间，并降低来自第二底物的产物产率。然而并且相反，大部分发酵研究着重于优化来自单一底物的产物形成。

因此需要开发下述方法，所述方法中可以优化来自多种底物的产物形成。加速同时或相继的混合底物利用并产生高产物产率的可能的发酵方法可包括：环境控制(例如pH、培养基组成、底物比例)；在大规模发酵前预诱导；代谢诱导物的鉴定和进料；新颖的反应器构型，如两阶段进料分批方法(例如在低浓度诱导物上需氧生长并产生高细胞密度，之后是混合糖的受控进料用于产物形成)；和使用特异性适应在混合底物上生长的微生物。

发明内容

本发明基于下述选择方法的开发，所述选择方法使得能够选出下述生物菌株，其能够在混合底物(即包含两种或更多种碳源的底物)上高效生长，尤其是与参照菌株相比更高效地生长。所述方法可尤其被用于选择能够在这样的底物上经改进地生长的生物菌株，即显示经改进的/更快的这类底物消耗的菌株。也就是说，本发明可被用于选出下述经改进的生物菌株，所述菌株已经能够利用混合底物，但是仅以较低速率利用。

用于进行本发明选择方法的生物的起始菌株在本文中可以被称作例如“起始”菌株、“参照”菌株或“初始”菌株等等。

在所述方法中，针对在混合底物上的生长来选择或构建所述生物的起始(或参照)种群。然后对所述种群进行本发明的选择方法。进行所述选择方法，使得所述生物种群在混合底物中各种碳源上的生长世代数至少是所述生物种群在最优选的碳源上生长的世代数的约50％。

本文所述的选择方法允许鉴定下述酵母菌株，所述酵母菌株在包含葡萄糖、木糖和阿拉伯糖的混合底物上生长时显示经改进的消耗。

因此根据本发明提供了用于选择下述生物菌株的方法，所述菌株能够在包含两种或更多种碳源的混合底物上比所述生物的参照菌株进行改进/更快的消耗，所述方法包括：

在存在两种或更多种碳源时培养所述生物的参照菌株的种群，其中所述种群在各种所述碳源上的生长世代数至少是在所述生物的参照菌株最优选的碳源上生长世代数的约50％；并

选择得到的所述生物的菌株，

从而选择与所述生物的参照菌株相比能够经改进地消耗包含两种或更多种碳源的混合底物的所述生物的菌株。

本发明还提供了：

-根据前述权利要求中任一项的方法鉴定的生物的菌株；

-能够有至少约0.4gh^-1(g干重)^-1阿拉伯糖比消耗速率和至少约0.2gh^-1(g干重)^-1木糖比消耗速率的酵母菌株，如Saccharomyces cerevisiae菌株；

-能够发酵包含木糖和阿拉伯糖、并任选地包含葡萄糖的底物，得到至少约0.4gg^-1乙醇产率的酵母菌株，如Saccharomyces cerevisiae菌株；

-以登记号CBS122701保藏于Centraalbureau voor Schimmelcultures的Saccharomyces cerevisiae菌株；

-用于生产发酵产物的方法，所述方法包括用上文所述生物的菌株发酵含有两种或更多种碳源的底物，从而所述细胞将所述碳源转化成所述发酵产物；

-用于生产发酵产物的方法，所述方法包括：

使用根据本发明的方法选择能够消耗包含两种或更多种碳源的混合底物的生物菌株；和